1、病理学常用研究方法,主讲人：王恩华,一、免疫组化标准化问题探讨,本世纪70年代问世抗体种类急速增加，交叉反应存在免疫组化技术方法不断问世使用的试剂或实验室条件不同操作人员的熟练程度病理医生的结果判定水平及关联知识解决标准化的问题势在必行,(一)方法的选择,目前常用的免疫组化方法有：PAP、ABC、APAAP法、S-P方法等各种方法只要运用得好，都会得到满意的结果建议：在我们省内都采用S-P法,S-P法的优点 方法统一 有配套的即用型抗体、试剂盒和显色试剂盒 一般2-3小时(30-60)，而ABC法需1天，分 子量小(60KD)，穿透力强 灵敏性高，特异性强，4个亚基都能于二抗上的生 物素结合，
2、而且结合键强 背景低，非特异性反应少，等电点为6.5，接近于 中性，不与内源性凝集素样物质结合,而ABC法为10,S-P法与ABC法的区别,S-P法：Streptaridin peroxidase conjugataed method 链霉菌素抗生物素蛋白过氧化物酶连接法ABC法： Avidin-Biotin peroxidase complex method 卵白素亲生物素过氧化酶复合物法,S-P法中的链霉菌素抗生物素蛋白取代了ABC方法中的卵白 素和生物素即：卵白素中的4个亚基一方面与第二抗体上的生物素结 合，另一方面还与复合物中的生物素结合,ABC法：,S-P法：,(二) 固定、包埋,固
3、定液：一般10%中性缓冲福尔马林，PH7.3-7.4(PBS配制)固定时间：应少于24小时，固定时间越长，抗原丢失越多固定液量或组织块大小：组织为1/3，固定液2/3大体标本：切下一块固定,包埋：起初免疫组化对蜡温的要求很严，温度一高会严重影响结果。现在由于抗体质量的提高，以及抗原恢复方法的问世，多数人又忽视了蜡温的问题。个人认为：尽管有抗原修复方法，但不如开始就不使抗原破坏，另外，蜡温过高，组织变脆，不易切成大片，容易脱片。因此，要控制蜡温在65以下,(三) 抗原修复(抗原暴露、抗原复原),组织中存在某种抗原、但用特异性抗体，却为阴性其原因是：固定、包埋后部分抗原决定簇与核酸或其它蛋白抗原发
4、生了交联，形成网络固定液中的醛基本身也会发生交联，而封闭抗原,抗原修复的目的：就是要打开交联，暴露抗原决定簇，有利于抗原抗体反应，抗原修复的方法从大的方面讲有两种：,热修复： 0.01M柠檬酸缓冲液，PH=6.0，95，10分钟注意：脱片多多聚L赖氨酸 干片 选医用微波炉酶消化：1.细胞内抗原0.1%胰蛋白酶 2037 2.间质抗原4%胃蛋白酶37，4-8小时,(八)免疫组织化学的发展,1. 免疫PCR：主要用于临床生物分子检测方面 血清(Ag)电泳+Ab+无关引物扩增显色 意义：1. 原来较弱、水平较低的酶等，用免疫PCR就可以检测出来 2. 需要较长或一定时间才能查出来用免疫PCR法，就可
5、提前查出来如：病毒性心肌炎、血肿CPK检测 心梗早期心肌酶谱的检测等,心梗预报：心绞痛一般认为没有酶 谱改变，设想用免疫PCR就可能发现改变,2. 原位免疫PCR在组织切片上有定位 Ag+Ab1+Ab2卵白素洗净生物素标记的DNA片断洗净原位PCR扩增洗净ACB或S-P显色 特点：提高阳性率 定位好,2. 扩增：,Total: 25l PCR buffer 2.5l mixed dNTP 2.0l dH2O 16.375l primer 1 1.0l primer 2 1.0l Taq 0.125l DNA template 2.0l94 25” 55 25” 72 40” 30 cycles
6、,3. Agarose 2-5%，用1TBE电泳 扩增后液 5l + 1l loading buffer 溴化乙淀染色 20，UV照射下确认泳带照相,4. DNA收集 RECOCHIP法,三、Western Blotting,1. 提取蛋白 500l的hypotonic buffer + 组织2mm3匀浆器粉碎 冰上放置30 15000转/分，4，30。上清：细胞质蛋白，+250l 3loading buffer沉淀物 + 750l loading buffer再次粉碎、离心，上清为细胞膜蛋白 2-氢硫基乙醇 7.5l(1/100)混合 95沸腾5分钟 冰上放置,2. 蛋白定量 标准蛋白浓度制备：BSA，0，0.5，1，2mg/ml 比色：测定系数 换算成含量 计算出每个样品加样量3. 电泳 丙烯酰胺 上部胶、下部胶 marker样品4. 转膜5. 洗膜 一抗、二抗 显色或自显影,
