微乳体系中脂肪酶催化棕榈酸制备生物柴油及其工艺优化.DOC

1、微乳体系中 脂肪酶催化棕榈酸制备生物柴油及其工艺优化 朱广琪 李芳浩 刘妍 王彩娜 谈忠琴 韩晓祥 （浙江工商大学应用化学系，杭州 310018） 摘 要 以十二烷基苯磺酸（ Dodecyl benzenesulfonic acid, DBSA） +TX-100/环己烷 /1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐（ BmimBF4）微乳体系为反应介质， Candida rugosa脂肪酶为催化剂，进行棕榈酸与乙醇酯化反应制备生物柴油，并考察离子液体用量、 醇酸 摩尔比 、脂肪酶用量、反应温度、反应时间等因素对棕 榈酸乙酯产率的影响。在单因素实验的基础上，根据中心组合 Box-Benhnken 实验设计

2、原理，采用响应面分析法对生物柴油制备工艺进行优化。结果表明生物柴油制备的最佳工艺条件为：离子液体 BmimBF4用量 30%， 醇酸摩尔比 6.3:1，脂肪酶用量 为棕榈酸质量的 14%，反应温度 34 时，反应时间 3.0 h，此条件下，棕榈酸乙酯的产率为 97.5%，该结果与模型预测值基本相符。 关键词 离子液体微乳体系 脂肪酶 棕榈酸乙酯 响应面法 中图分类号： TQ645 文献标识码： A 文章编号： Optimization and Preparation of Biodiesel from Palmitate Acid using Candida Rugosa Lipase as

3、Catalyst in Microemulsion System Zhu Guangqi Li Fanghao Liu Yan Wang Caina Tan Zhongqin Han Xiaoxiang (Department of Applied Chemistry, Zhejiang Gongshang University, Hangzhou 310018) Abstract Biodiesel was prepared via esterification of palmitate acid and ethanol in the dodecyl benzenesulfonic acid

4、 (DBSA) +TX-100/ cyclohexane/ 1-Butyl-3-methylimidazolium tetrafluoro- borate (BmimBF4) microemulsion system with Candida rugosa lipase as catalyst. The effects of several parameters such as the amount of ionic liquid, molar ratio of reactants, the amount of lipase, reaction temperature and reaction

5、 time on the yield of ethyl palmitate were investigated. On the basis of single factor experiments, the preparation process of biodiesel was optimized by response surface methodology (RSM) based on the BoxBehnken design (BBD). Accordingly, a maximum ethyl palmitate yield of 97.5% was obtained under

6、the optimal conditions: amount of ionic liquid BmimBF4 30%, ethanol/acid molar ratio of 6.3, the amount of lipase to palmitate acid 14%, reaction temperature 34 and reaction time 3.0 h. These results were basically agreement with predicted value by a mathematical model. Key words ionic liquid microe

7、mulsion system, lipase, ethyl palmitate, response surface methodology 收录日期： 2017-09-14 作者简介： 朱广琪，女， 1993 年出生，硕士研究生，食品科学与工程 通讯作者： 韩晓祥，男， 1974 年出生，副教授，食品化学。电话： 13136171144， Email：. 生物柴油是一种新型的可再生绿色能源，它具有闪点高、抗爆性好 、 燃烧性能优良 、 能有效降低 SOx， NOx等有害温室气体排放量等 优 点。 生物柴油是一种高级脂肪酸酯类化合物，可以通过动植物油脂、餐饮废油等为原料与低级醇经过酯交换或酯化反

8、应制备得到 。 在传统制备工艺中，常采用浓硫酸作为催化剂。浓硫酸催化时虽有较高催化活性，但存在易发生副反应，产品不易提纯，设备腐蚀严重，环境污染严重等缺点，工艺路线不符合当今社会可持续发展的要求。采用固体酸、金属盐类、离子液体等催化剂 1-5，虽然在一定程度上解决了传统催化剂存在的一些缺点，但它们仍存在相对活性低、表面易积碳、酸中心分布不均、再生困难等缺陷，从而限制了它们的应用。 微乳体系是指由油、水、表面活性剂和助剂按照一定比例自发形成的热力学稳定的、外观透明或半透明的高度分散体系，具有超低的界面张力，稳定的热力学特性且价格低廉，广泛用于聚合反应、酶催化 反应 、分离及纳米材料制备等领域 6

9、-13。脂肪酶作为一种生物催化剂，在催化反应 中 常具有很高的立体选择性和区域选择性，微乳体系中进行脂肪酶催化反应已有文献报道，微乳体系为脂肪酶提供了适宜的作用环境，从而使脂肪酶显现 出 较好的催化性能 14-19。 离子液体，主要由含氮元素的有机阳离子与无机阴离子形成的，在室温下呈液态的离子化合物。离 子液体不仅可以作为催化剂，还能作为绿色溶剂广泛的应用于多个领域20。近年来，通过离子液体构建离子液体微乳液备受关注，离子液体微乳液作为一种新型体系，同时具备了离子液体和微乳液二者的优点，在纳米材料的制备，蛋白质萃取分离，医药及化工领域已经得到了应用 21-23。 本试验以棕榈酸为模型反应原料，

10、 DBSA+TX-100/环己烷 /BmimBF4离子液体微乳体系为反应介质，考察了 醇酸 摩尔 比 、脂肪酶用量、反应温度、反应时间等因素对 Candida rugosa脂肪酶催化合成棕榈酸乙酯产率的影响，并采用响应面分析法 对该合成反应条件进行优化 ，以期为生物柴油的绿色制备和高酸值餐饮废油脂的清洁利用提供参考。 1 材料与方法 1.1 材料与仪器 十二烷基苯磺酸（ DBSA）：日本 Tokyo Kasei Kogyo有限公司； Candida rugosa脂肪酶：Sigma-Aldrich公司；曲拉通（ TX-100）： 上海如吉生物科技发展有限公司； 1-丁基 -3-甲基咪唑四氟硼酸盐

11、（ BmimBF4） ：阿拉丁试剂公司 ；环己烷、棕榈酸、乙醇、氢氧化钠、酚酞及其他试剂：迈瑞化学试剂公司 ， 皆为分析纯 。 GC7890B气相色谱仪，安捷 伦公司； GL-3250A磁力搅拌器： 海门市其林贝尔仪器制造有限公司； DZF-6050真空干燥箱：上海博迅实业有限公司 。 1.2 试验方法 1.2.1 微乳体系的制备 称取一定质量的 DBSA+TX-100与环己烷混合于小烧杯中， 在 磁力搅拌 的作用 下 ， 搅拌均匀后向体系中滴加 BmimBF4，直至溶液由澄清变浑浊或者由浑浊变澄清，变化临界点即为相变点。根据三组分中各质量得到溶液的组成分数，整理数据，采用 Origin 8.

12、5 绘制三元相图。整个实验过程在 30 环境 下进行。 根据所绘制的三相图，在微乳区中任 取几个特殊点，根据各组分的质量分数算出每个组分的质量，配成微乳体系。在相同的反应条件下进行棕榈酸乙酯的合成。酯化反应结束后，用气相色谱法检测棕榈酸的转化率，进而确定微乳区的最大反应点，并将此最大反应点作为研究棕榈酸酯化反应单因素影响的反应点。 1.2.2 微乳体系中棕榈酸乙酯的合成 在圆底烧瓶中分别加入形成微乳体系的三种组分，磁力搅拌 30 min，形成均匀澄清透明的微乳体系。向微乳体系中加入棕榈酸、乙醇及脂肪酶，在水浴条件下进行酯化反应。酯化产物在 Agilent 7890B气相色谱仪上进行定量分析，

13、FID检测器， HP-5毛细管柱，月桂酸甲酯为内标物。 2 结果与分析 2.1 离子液体微乳中脂肪酶催化酯化反应 离子液体微乳体系的形成对酯化反应有着重要的影响，实验研究了 DBSA， TX-100等表面活性剂对 BMIMBF4/环己烷形成微乳液的影响。研究发现单独 DBSA与离子液体不能形成微乳体系，而单独的 TX-100可以与离子液体形成微乳体系 ， 当 DBSA与 TX-100形成复配表面活性剂 同样 可以与 BMIMBF4及环己烷形成微乳体系 。 微乳体系三相图如图 1所示， 由图 1可见，表面活性剂对该离子液体微乳液的形成有重要 作用，当表面活性剂的比例较小时，通常不能形成微乳液，随

14、着表面活性剂所用比例的增加，微乳区逐渐扩大，并且也越稳定。 (a) DBSA+TX-100/环己烷 /BMIMBF4 (b) TX-100 /环己烷 /BMIMBF4 图 1 微乳体系三相图 在三相图的微乳区中寻找不同离子液体含量的点，根据不同点三组分的比率，配制离子液体微乳体系，考察离子液体含量对脂肪酶催化合成棕榈酸乙酯的影响。离子液体含量是影响微乳体系中脂肪酶活性的一个重要因素， 离子液体用量对微乳体系中脂肪酶催化酯化反应的影响如图 2所示 。 由图 2可知，随着微乳体系中离子液体含量的增加，棕榈酸乙酯的产率逐渐增长，当体系中离子液体含量达到 30%时，棕榈酸乙酯产率出现了一个峰值。随后，

15、继续增加离子液体用量，棕榈酸乙酯的产率呈现下降的趋势。一般来说，微乳体系中，酯化反应发生在相界面处，相界面处的面积越大，底物分子间的接触越充分，从而反应速度加快，提高反应产率。随着离子液体用量的增加，界面增加，反应过程中生成的水不仅提高酶的活力，也可参与微乳体系的形成，从而进一步 促进 反应平衡向右移动，棕榈酸乙酯产率增加。离子液体 的过多 存在可能 会 影响脂肪酶的活性，从而 导致酯化反应活性降低，棕榈酸乙酯产率降低，因此，试验中选择离子液体含量 30%为宜。 10 20 30 405060708090100产率 /%离子液体用量 /%图 2 离子液体用量对微乳体系中脂肪酶催化酯化反应的影响

16、 2.2 反应条件对 脂肪酶催化合成棕榈酸乙酯的影响 酯化反应是一个可逆反应，常通过增加反应物的量来提高反应转化率， 不同反应条件对离子液体微乳体系中脂肪酶催化酯化反应的影响如图 3所示。 由图可见， 当 离子液体用量为30%，脂肪酶浓度为 12%，反应时间为 3.0 h时，不同 醇酸摩尔比 对 棕榈酸 酯化反应的影响较大 。在所考 察的范围内，随着 乙 醇用量的增加，棕榈酸乙酯产率逐渐上升，当 醇酸摩尔比 为6:1时，棕榈酸乙酯产率最高为 95.8%，进一步增加 乙醇 用量，棕榈酸乙酯产率下降。这是因为增加 乙 醇 的 浓度，即增加了反应物的浓度，有利于反应向酯化反应方向进行。但是随着 醇酸

17、摩尔比 进一步增加，反应体系中过高的 乙 醇浓度对脂肪酶活性有抑制作用，同时反应体系体积增大，催化剂浓度变稀，反应速度变慢，棕榈酸转化率下降。因此， 醇酸摩尔比 选为 6:1。 酶浓度的增加有利于反应速率增加，但是过量的酶也 会对反应产生 不利影响， 本试验在研究脂肪酶用量对棕榈酸酯化反应 的影响 时 ，获 得了脂肪酶用量适宜值 ， 具体 结果见 图 3，由图可见，无脂肪酶存在时，该微乳体系中进行酯化反应具有一定的催化活性 ，而在 TX-100/环己烷 /BMIMBF4 微乳体系 中进行 催化 酯化制备棕榈酸乙酯时 ， 棕榈酸乙酯产率小于 5%，由此说明微乳体系中 DBSA 不仅 与 TX-1

18、00 结合 作为表面活性剂与环己烷、 离子液体 形成微乳体系，还可作为 Brnsted 酸催化酯化反应。有脂肪酶存在时，催化酯化反应活性进一步增加，且棕榈酸转化率随着脂肪酶用量的增加而增加，当脂肪酶用量为 12%时，棕榈酸乙酯产率达到最大为 95.8%，进一步增 加脂肪酶用量，棕榈酸乙酯产率增幅不明显。这可能是因为酶浓度在一定范围内增加时，随着酶用量的增加， 使得 酶分子中越来越多的活性部位与底物 分子 接触 24， 从而加快 反应速度，使 棕榈酸 转化率快速增加 ； 但当酶的活性部位增加到一定程度时，由于蛋白质的聚集作用而不再与底物接触，反应速率 即 几乎不再增加 ，棕榈酸乙酯产率基本保持不

19、变。 因此选择加酶量为 12%。 温度对酶催化反应的影响主要有两个方面，提高反应温度，一方面可以提高反应速率，另一方面 过 高的反应温度会使酶失活，不利于酯化反应的进行。由 图 3 可见，随着反应温度的升高，反应速 率加快，棕榈酸转化率增加，在 35 时棕榈酸乙酯的产率达到最大值，脂肪酶此时表现出最大的催化活力。进一步升高反应温度，虽然有利于 DBSA 的酸催化作用，但酶的催化活性受到抑制， 两者相互作用的结果， 使得棕榈酸乙酯的产率呈下降趋势。通常条件下，延长反应时间有助于反应进行。由 图 3 可见，脂肪酶存在 时 ，随着反应时间的延长，棕榈酸乙酯产率增加，当反应时间为 3.0 h 时，棕榈

20、酸乙酯产率为 95.8%，进一步延长反应时间，棕榈酸乙酯产率基本保持不变。因此反应时间以 3.0 h 为宜。 0 2 4 6 80204060801000 5 10 15 2025 30 35 40 450 2 4 6 8产率/%醇酸摩尔比醇酸摩尔比脂肪酶用量/ %脂肪酶用量反应温度/ 反应温度 反应时间/ h反应时间 图 3 不同反应条件对离子液体微乳体系中脂肪酶催化酯化反应的影响 2.3 响应面法优化生物柴油制备工艺 2.3.1 分析因素的选取及分析方案 根据 Box-Benhnken 的中心组合试验设计原理，综合单因素试验结果，选取 醇酸摩尔比 、脂肪 酶用量、反应温度这三个因素，采用三

21、因素三水平响应面分析方法确定棕榈酸乙酯制备的 最佳工艺条件， 试验因素水平及编码表见表 1，响应面实验设计方案和实验结果见表 2。试验 1 12 是析因试验， 13 17 是中心试验，中心试验重复 5 次， 用于估计试验误差。 表 1 试验因素水平及编码表 因素 变量 编码水平 -1 0 1 脂肪酶用量 / % A 8 12 16 醇酸摩尔比 B 4 6 8 反应温度 / C 30 35 40 表 2 响应面实验设计方案和实验结果 试验号 变量水平 产率 / % A B C 1 -1 -1 0 65.6 2 1 -1 0 75.0 3 -1 1 0 59.8 4 1 1 0 85.5 5 -1

22、 0 -1 70.9 6 1 0 -1 85.2 7 -1 0 1 69.9 8 1 0 1 80.0 9 0 -1 -1 70.2 10 0 1 -1 76.1 11 0 -1 1 60.5 12 0 1 1 66.9 13 0 0 0 93.2 14 0 0 0 97.7 15 0 0 0 95.1 16 0 0 0 97.9 17 0 0 0 95.3 2.3.2 模型的建立与显著性检验 二次多项式预测反应回归模型的系数及方差分析结果见表 3。 根据方差分析表 3 及分析方程回归结果可知，该模型 F 值为 37.32， P(0.0001)值极低，说明该模型的回 归效果高度显著，回归模型相

23、关系数 R2 为 0.9796，表明模型拟合度较好，能准确的预测反应结果。此外， Adj.R2 为 0.9533，也表明该模型极显著。 此外，失拟项 的 F 值为 3.58 表明失拟项与绝对误差不显著，说明该模型能够适用于本试验的大部分数据，可以预测棕榈酸乙酯生产过程中产率变化及各因素对产率的影响。综上所述，该模型能够用来预测本试验，准确可靠。以棕榈酸乙酯产率为响应值，通过 RSM 软件对模型进行多元回归分析，回归方程的二次项系数见表 3，该 二次多项回归方程可拟合为： Y = + 95.84 + 7.44A + 2.13B- 3.14C - 8.14A2 - 16.22B2 - 11.20C

24、2 + 4.08AB - 1.05AC + 0.13BC 表 3 二次多项式预测反应回归模型的系数及方差分析结果 项目 平方和 自由度 均方 F 值 P 值 显著性 模型 2744.86 9 304.98 37.32 0.0001 * A 442.53 1 442.53 54.15 0.0002 * B 36.13 1 36.13 4.42 0.0736 C 78.75 1 78.75 9.64 0.0172 * A2 279.33 1 279.33 34.18 0.0006 * B2 1107.74 1 1107.74 135.55 0.0001 * C2 527.7 1 527.7 64.

25、57 0.0001 * AB 66.42 1 66.42 8.13 0.0247 * AC 4.41 1 4.41 0.54 0.4865 BC 0.063 1 0.063 7.65E-03 0.9328 残差 57.2 7 8.17 失拟项 41.69 3 13.9 3.58 0.1247 净误差 15.51 4 3.88 总离差 2802.07 16 注：“ *”表示该项具有显著性效应；“ *” 表示该项具有极显著效应。 2.3.3 因素间的交互影响 因素交互作用对棕榈酸乙酯产率影响的等高线和响应曲面图如图 4 所示。 由图可以简单直观地看出各因素对棕榈酸乙酯产率的影响，以及两独立因素间交

26、互作用 的 强弱。 图 4（ a）和（ d）表示 醇酸摩尔比 、脂肪酶用量及这两个因素之间的交互作用对棕榈酸乙酯产率的影响。当醇酸物质的量比和脂肪酶用量均为最小值时，随着脂肪酶用量和醇酸物质的量比增加，酯化产率也逐渐增加。随后 ，继续 增加 醇酸摩尔比 ，棕榈酸乙酯产率减小，这是因为过量的醇不利于酶活性表达，从而不利于棕榈酸乙酯产率的提高。从图 4（ a）和（ d）的等高线及响应曲面图可以看出，脂肪酶用量和 醇酸摩尔比 的相互作用显著，这与表3 的分析结果一致。 图 4（ b）和（ e）表示脂肪酶用量，反应温度对棕榈酸乙酯产率的影响及两者的交互作用关系。从图中可以看到脂肪酶用量和反应温度均对棕

27、榈酸乙酯的产率有重要影响。反应温度一定时，随着脂肪酶用量的增加，棕榈酸乙酯的产率持续增加，当脂肪酶用量达 13 %左右产率最高， 继续增加脂肪酶用量，产率变化不大。当脂肪酶用量保持不变时，随着反应温度的升高棕榈酸乙酯的产率出现先逐步增长后降低的趋势。较高的温度不利于酶促反应的进行，所以当温度升高时反应产率呈下降趋势。 图 4（ c）和（ f）表示离子液体微乳体系 中 反应温度和 醇酸摩尔比 对棕榈酸酯化反应的影响及两者之间的交互作用强弱。随着 醇酸摩尔比 以及反应温度的升高，棕榈酸乙酯的产率呈现出逐渐升高的趋势，达到峰值后继续增加任一因素，产率都呈现下降趋势。从图 4（ c）可以看出等高线图呈

28、圆形 25，说明两个因素间的交互作用不明显，这也与表 3 分析结 果一致。 图 4 因素交互作用对棕榈酸乙酯产率影响的等高 线 和响应曲面图 2.3.4 最佳工艺条件的确定 结合回归模型的数学分析可知，经过响应面优化法得到离子液体微乳体系中脂肪酶催化酯化反应的最佳条件是： 离子液体用量 30%， 醇酸摩尔比 6.26:1， 脂肪酶用量 为 棕榈酸质量的 13.99%， 体系反应温度是 34.19 ，棕榈酸乙酯的产率为 98.09%。 考虑到实际操作的方便，将最佳反应条件修正为 离子液体用量 30%， 醇酸摩尔比 6.3:1， 脂肪酶用量是 14%， 体系反应温度是 34 。在最佳条件下进行三组

29、平行实验，棕榈酸乙酯平均产率为 97.5%，与理论预测值基本相符。因此，该回归模型能够真实地反应各因素对棕榈酸乙酯产率的影响。 3 结 论 脂肪酶存在时， 在 DBSA+TX-100/环己烷 /BmimBF4 微乳体系中制备棕榈酸乙酯具有较好的催化活性。微乳体系中 DBSA 一方面作为表面活性剂参与微乳体系的形成，同时作 为Brnsted 酸催化酯化反应的进行，脂肪酶与 DBSA 的 协同作用 是使该酯化反应获得 较高产率的原因。 经过响应面优化， DBSA+TX-100 /环己烷 /BmimBF4 微乳 体系中脂肪酶催化合成棕榈酸乙酯的较佳工艺条件为：离子液体用量 30%， 醇酸摩尔比 6.

30、3:1， 脂肪酶用量 为棕榈酸质量的 14%， 反应温度 34 ， 反应时间 3.0 h。在此条件下，棕榈酸乙酯产率为 97.5%。 该结果与模型预测值基本相符。 试验结果为高酸值餐饮废弃油脂清洁制备生物柴油提供了一定的理论基础与实践经验。 参考文献 1 饶蔚兰 , 潘志权 , 向守信 . 稀土固体超强酸的制备及其对硬脂肪酸酯化反应的催化 J. 应用化学 , 2011, 28(8): 907-912 RAO W L, PAN Z Q, XIANG S X. Preparation of rare earth solid superacid and catalysis on the esteri

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46、中的应用 J. 化学进展 , 2013, 25(5): 661-668 CHEN X W, MAO Q X, WANG J H. Ionic liquids in extraction/separation of proteinsJ. Process in Chemistry, 2013, 25(5): 661-668 24 Ghamgui H, Miled N, Reha A, et a1. Production of monoolein by immobilized staphy lococcus simulans lipase in a solvent-free system: opti

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