1、实验九 聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点一、目的要求1.学习和掌握圆盘电泳技术2.学习和掌握 等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点方法二、原理聚丙烯酰胺等电聚焦电泳 (Isoelectric Focusing-PAGE， 简称 IEF-PAGE)： 利用各种蛋白质 pI不同，以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持物，并在其中加入两性电解质载体 (carrier ampholytes)， 两性电解质载体在电场作用下，按各自 pI形成从阳极到阴极逐渐增加的平滑和连续的 pH梯度。在电场作用下，蛋白质在此 pH梯度凝胶中泳动，当迁移至 pH值等于 pI处时，就不再泳动，而被浓缩成狭窄的区带。 两性电解质载
2、体 (carrier ampholytes)(1)易溶于水，在 pI处应有足够的缓冲能力，形成稳定的 pH梯度，不致被蛋白质或其它两性电解质改变 pH梯度。(2)在 pI处应有良好的电导及相同的电导系数，以保持均匀的电场。(3)分子量小，可通过透析或分子筛法除去，便于与生物大分子分开。(4)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，也无变性作用，其化学组成不同于蛋白质。IEF-PAGE分离蛋白质并测定 pI图 3.6聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图(A为正面 ,B为剖面 )(1)样品胶 pH6.7 (2)浓缩胶 pH6.7 (3)分离胶 pH8.9 (4)电极缓冲液 pH8.3三、试剂与器材试剂：两性
3、电解质载体 pH 3-10 、 10%四甲基乙二胺 、 10%过硫酸铵 、 5%H3PO4 、 2%NaOH 、 40%蔗糖 、 0.04考马斯亮兰 R250 、 7%醋酸器材：圆盘电泳槽 、稳压稳流电泳仪 、脱色摇床四、操作方法1. 凝胶柱的制备（ 1）玻璃管的一端插在橡皮帽中 (与橡皮接触的部分凝胶不易聚合，可在橡皮帽中先加一滴 40%的蔗糖 )（ 2）配胶表 10mL 7.5%凝胶的配制试 剂 名 称 体积 (mL) 凝胶贮液 2.5 两性电解质载体 0.5 10%TEMED 0.1 蛋白质混合样品 0.1 蒸馏水 6.75 混匀后置真空干燥器中抽气 10 min 10%过硫酸铵 0.0
4、5 （ 3）将配好的凝胶溶液用细长头滴管加到预先准备好的玻管中， 至离上端 1 cm处 ，再用注射器缓缓加水 3-5 mm高。（ 4）待凝胶聚合2. 电泳小心地拔出玻管，并用蒸馏水洗去蔗糖溶液，把管固定到电泳槽上槽的洞中 （安装时要保证凝胶管垂直且橡胶塞孔密封不漏） 在上槽中加入 5%磷酸缓冲液，在下槽中装入2%氢氧化钠溶液。 避免管下有气泡 。上槽接电泳仪的正极，下槽接负极，打开电源，先调电压至 100 V， 待电压稳定后再升到 300 V， 电泳 2 h以上至电流降为 0，将电压调至 0，关闭电源。3剥胶 电泳结束后，取下凝胶管，用蒸馏水充分洗净两端电极液， 在凝胶条的正极端插一铜丝为标记 。用灌满水的注射器长针头插入凝胶与玻管管壁之间，边压水边慢慢转动玻管，推针前进，同时注入水，靠水流压力和润滑力将玻璃管内壁与凝胶分开，凝胶条即可流出。 4 .固定染色取其中一条凝胶条放在一块洁净的玻板上，用尺量出固定前的凝胶条长度。放入染色液中同时进行固定染色 1-2 h， 用蒸馏水漂洗数次后用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰，量出蛋白带距正极端的距离。
