1、实验二 质粒 DNA电泳鉴定生物技术制药实验武汉大学药学院实验教学中心 生物技术实验室主讲教师：刘永梅刘永平实验目的u掌握琼脂糖凝胶电泳分离 DNA的原理；u学习琼脂糖凝胶电泳的操作方法 实验原理及背景知识简介 电泳是分离和纯化 DNA片段的最常用技术。如 DNA制备、浓度测定、目的DNA片段分离，重组子的酶切鉴定等均需要电泳完成。 根据分离的 DNA大小及类型的不同， DNA电泳主要分两类： 聚丙烯酰胺凝胶电泳 适合分离 1kb以下的片段，最高分辨率可达 1bp，也用于分离寡核苷酸，在引物的纯化中也常用此中凝胶进行纯化，也称 PAGE纯化。 琼脂糖凝胶电泳 可分离的 DNA片段大小因胶浓度的
2、不同而异，胶浓度为0.5 0.6%的凝胶可以分离的 DNA片段范围为 20bp 50kb。电泳结果用溴化乙锭（ EB）染色后可直接在紫外下观察，并且可观察的 DNA条带浓度为纳克级，而且整个过程一般 1小时即可完成。由于该方法操作的简便和快速，在基因工程中较常用。琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是一种线性多糖聚合物。 浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。琼脂糖浓度琼脂糖浓度 (%) 线型线型 DNA分子的分离范围分子的分离范围 (Kb)0.3 5 600.6 1 200.7 0.8 100.9 0.5 71.2 0.9 61.5 0.2 312.0 0.1 2分离原理 DNA分子在碱性环境中带 负电荷
3、 ，在外加电场作用下向正极泳动 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有 电荷效应 与 分子筛效应 。不同的 DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带 琼脂糖凝胶电泳法分离 DNA，是利用 分子筛效应 ，迁移速度与分子量的对数值成反比关系 可依据 DNA分子的大小使其分离DNA分子在高于等电点的 PH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定电场强度下， DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数成反比。电泳原理DNA电泳影响因素（一）u DNA分子大小 DNA分子越大在胶中的摩擦阻力就越大，泳动也越慢，迁移速率与线状 DNA分子质量的对数值成反比。u DNA分子构型 构
4、型不同，电泳时受到的阻力不同，导致泳动速率的不同。常规电泳中质粒 DNA分子的 3种构型泳动速率：超螺旋最快、线状分子次之，开环分子最慢。 u 胶浓度 对于同种 DNA分子胶浓度越高，电泳速率越慢。浓度较稀的胶线性范围较宽，而浓的胶对小分子 DNA片段呈现较好的线性关系。所以常规实验中对于小片段 DNA分子的分离采用高浓度的胶分离（有时甚至用 2的凝胶），而对于分离大片段则用低浓度的凝胶。 DNA电泳影响因素（二）o 电场强度 一般约为 5V/cm。 分辨率不高。在精确测定 DNA分子大小时，应降低电压至 1V/cm。电场强度偏高，分离的线性范围变窄，也会大量产热导致 DNA片段的降解。选择合
5、适电压，如对于大片段 DNA的分离可选择较低电压进行（在 Southern杂交中的 DNA电泳），避免托尾现象的产生；而对于小分子 DNA，由于其在凝胶中的快速扩散会导致条带模糊，可选用相对较高的电压以缩短电泳时间。 o 溴化乙锭 EB，具有扁平结构，能嵌入到 DNA碱基对间，对线状分子与开环分子影响较小而对超螺旋态的分子影响较大。当 DNA分子中嵌入的 EB分子逐渐增多时，原来为负超螺旋状态的分子开始向共价闭合环状转变，电泳迁移速度由快变慢；当嵌入的 EB分子进一步增加时， DNA分子由共价闭合环状向正超螺旋状态转变，这时电泳迁移速率又由慢变快。这个临界点的游离 EB质量浓度为 0.1g/ml0.5g/ml，即电泳时所加的浓度。对于特殊电泳，消除此因素影响可采用电泳后染色。 o 电泳缓冲液 目前有 3种缓冲液适用于天然双链 DNA的电泳： TAE、 TBE和 TPE，其组成及特点见表 2.2。一般常用的 DNA电泳选用 TAE较多，其电泳时间较快，而且成本比较低，但是其缓冲容量较低，需经常更换电泳液。DNA电泳影响因素（三）琼脂糖凝胶电泳中常用的缓冲液Tris-硼酸（ TBE） Tris-乙酸（ TAE） Tris-磷酸（ TPE）
