湘西永顺产山苍子精油成分分析与抑菌活性研究.DOC

1、湘西永顺产山苍子精油成分分析与抑菌活性研究彭湘莲 1,2 付红军 1* 刘微微 1（1.中南林业科技大学食品科学与工程学院，长沙410004；2. 稻谷及副产物深加工国家工程实验室，长沙410004）摘 要 研究湘西永顺产山苍子精油的成分分析及其抑菌活性。采用水蒸气蒸馏法提取山苍子，利用气相色谱-质谱法分析山苍子精油的化学成分，选取大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白曲霉、青霉四种菌种为代表菌种，通过平板计数、最低抑菌浓度、不同热处理以及不同pH值来探讨山苍子精油的抑菌活性。结果表明：湘西永顺产山苍子精油的主要成分柠檬醛含量为74.07%。其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白曲霉、青霉四种菌的最低抑菌浓度

2、分别为1.88 、0.94、0.94、0.47 L/mL。山苍子精油能抑制细菌和霉菌的生长。当热处理温度在40100区间时，温度升高导致山苍子精油的抑菌活性下降；当pH 值在3.57.5 的范围内，pH 值越小山苍子精油的抑菌效果越好。湘西永顺产山苍子精油成分分析为其开发利用提供了技术参数，通过对其抑菌活性的研究，为研发山苍子精油防腐保鲜剂提供理论参考，拓展其在我国生鲜食品防腐保鲜中的应用。关键词 山苍子精油 GC-MS 抑菌活性 中图分类号：TS202 文献标识码： A 文章编号：1003-0174（ ） - - Antibacterial Activity Research and Com

3、position Analysis on Litsea cubeba Essential Oil Produced in West Yongshun of Hunan ProvincePeng Xianglian1,2 Fu Hongjun1* Liu Weiwei1(1.College of Food Science and Engineering, Central South University of Forestry and Technology, Changsha, 410004; 2.National Engineering Laboratory for Rice and Bypr

4、oducts Processing, Changsha 410004)Abstract Study on constituents and antibacterial activities of litsea cubeba essential oil produced in west yongshun of hunan province. The decoction of litsea cubeba was extracted by steam distillation. The chemical constituents of litsea cubeba essential were ana

5、lyzed by gas chromatography-mass spectrometry. Four strains of escherichia coli, staphylococcus aureus, aspergillus oryzae, plate count, the minimum inhibitory concentration, different heat treatment and different pH to explore the antimicrobial activity of litsea cubeba essential oil. The results s

6、howed that the main component citral content of yongshun litsea cubeba essential oil in xiangxi was 74.07%. The minimum inhibitory concentrations against escherichia coli, staphylococcus aureus, aspergillus niger and penicillium respectively were 1.88, 0.94, 0.94 and 0.47 L/mL. Litsea cubeba essenti

7、al oil can inhibit the growth of bacteria and mold. When the heat treatment temperature was in the range of 40100, the antibacterial activity of litsea cubeba essential oil decreased. When pH value is in the range of 3.57.5, the inhibitory effect of litsea cubeba essential oil is better when the pH

8、value is lower. The composition analysis of litsea cubeba essential oil in yongshun of western hunan provided technical parameters for the development and utilization of litsea cubeba essential oil. By studying its antimicrobial activity, it provided a theoretical reference for the research and deve

9、lopment of litsea cubeba essential oil anticorrosive preservative, and expanded its preservation in preservation of fresh food in china applications.Keywords litsea cubeba essential oil, GC-MS, antibacterial activity山苍子( Litsea cubeba) 别名山鸡椒，属于樟科木姜子属植物，在我国广泛种植，主要分布于湖南、湖北、江西 、浙江 、福建 、云南等地 1。山苍子油是从山苍子

10、果实或其他组织中提取出来黄色油状液体，由于产地地理条件的差异导致其成分会有所不同。山苍子油中的活性成分主要有柠檬醛、D-柠檬烯、马鞭烯、芳樟醇、香叶醇、香茅醇等成分，其中抑菌效果较好的为柠檬醛 2。研究表明，山苍子油具有一定的抑菌活性，其对大部分的真菌和细菌具有一定的抑制或灭杀作用 3-4。余伯良 5等采用平板法研究山苍子油对花生酱的防霉保鲜效果，结果表明当培养基 pH 5.5时，山苍子油对多数霉菌的最低抑菌浓度为 1.77 mg/mL。李文茹等 6使用了平板菌落计数法进行山苍子精油的抑菌实验，山苍子精油对黑曲霉和绳状青霉的最低抑菌浓度分别为0.125%和0.25%，山苍子精油对大肠杆菌和金黄

11、色葡萄球菌的最低抑菌浓度均为0.125%。吴均 7等采用抑菌圈实验对山苍子油的抑菌活性进行测定。5%的山苍子油在含有金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的培养基中有抑菌圈生成，而在含有大肠杆菌的培养基中未出现抑菌圈。目前我国对于山苍子油的用途主要为食用香料，由于其无毒且有显著的抑菌效果，使得在食品防腐保鲜领域备受青睐。本文选用湘西永顺产山苍子果实，采用水蒸气蒸馏法 8提取山苍子精油，利用气相色谱-质谱法分析山苍子精油的化学成分，选取大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白曲霉、青霉四种菌种为代表菌种，通过测定平板菌落计数、最低抑菌浓度、热处理影响以及pH值影响来测定山苍子精油的抑菌活性，为山苍子精油的开发应用提供

12、科学依据。1 材料与方法1.1材料基金项目：湖南省教育厅优秀青年项目（16B282），湖南省自然科学基金面上项目（2017JJ2411）收稿日期：2018-02-25作者简介：彭湘莲，女，1976年出生，副教授，食品质量与安全专业 通讯作者：付红军，男，1975年出生，讲师，森林食品加工与利用1.1.1材料与试剂新鲜山苍子果实（采自湖南省湘西永顺土家族苗族自治州）；石油醚（30-60 沸程 )（分析纯，天津市恒兴化学试剂制造有限公司）；结晶紫中性红胆盐琼脂、Baird-Parker琼脂培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（生化试剂，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司提供）；其他试剂均为分析纯。大肠

13、杆菌、金黄色葡萄球菌、白曲霉、青霉（中南林业科技大学食品科学与工程学院微生物实验室提供）。1.1.2仪器与设备Clarcus 600 GC-MS联用仪（美国Perkin Elmer 公司）； WK-10B高能性中药粉碎机（山东青州市精诚机械制造有限公司）；MJ-54A型高压蒸汽灭菌锅（施都凯仪器设备有限公司）； SW-CJ-2F型双人双面净化工作台（苏州净化设备有限公司）等。1.2实验方法1.2.1水蒸气蒸馏法提取山苍子精油将山苍子果实阴干后粉碎后过20 目筛，密封保存于冰箱备用。称取50 g粉末样品置于1000 mL圆底烧瓶中，并加500 mL蒸馏水，用电热套进行水蒸气蒸馏提取直至无挥发油产

14、生，用石油醚收集油层，待石油醚挥发后称量。按中国药典2010 版一部附录 XD 挥发油测定法测定山苍子干果中山苍子精油含量，平行测定 3 次，取平均值，并将山苍子精油置于冰箱保存，用于后续GC-MS分析和抑菌活性测定。1.2.2山苍子精油的成分分析（GC-MS）采用美国Perkin Elmer公司Clarcus 600气质联用分析仪。GC条件：色谱柱为Elite-5MS（30 m0.25 mm，0.25 m）；升温程序: 80保持 3 min，5/min升温至100，保持1 min， 10/min 升温至130，保持3 min，20/min升温至230，保持6 min； 载气为高纯氦气；进样口

15、温度250；进样量0.5 L；分流比50:1。MS条件：电子轰击离子源进样方式；电离电压70 eV；离子源温度240；传输线温度280；质量扫描范围m/z 35500。山苍子精油的GC-MS定量分析采用峰面积归一化法，化合物定性采用NIST标准谱库 9。1.2.3菌种的活化及菌悬液的制备配制适量培养基，高压蒸汽灭菌之后倒于无菌培养皿之中，待冷却凝固后，将大肠杆菌接种在结晶紫中性红胆盐琼脂平板上，将金黄色葡萄球菌接种在Baird-Parker琼脂平板上， 34培养 24 h；将白曲霉、青霉2种霉菌转接到马铃薯葡萄糖琼脂培养基斜面中活化，28培养 48 h。挑取少量菌落于无菌生理盐水中，细菌采用平

16、板计数法，霉菌使用显微镜直接记数法测菌体个数，将菌悬液浓度调至 10 610 7 CFU/mL，备用。 1.2.4平板菌落计数法1 mL山苍子精油加10 mL无菌培养基混匀冷却，1 mL丙三醇加10 mL无菌培养基作为空白对照；冷却后将取200 L菌悬液涂布于平板培养基上，按1.2.3的条件进行培养，每个菌种做三组平行，观察菌落生长情况。1.2.5最小抑菌浓度的测定采用二倍稀释法，配制一系列梯度浓度的山苍子精油丙三醇溶液，与熔融的培养基混匀，使得培养基中山苍子精油的浓度分别为30、15、7.5、3.75、1.88、0.94、0.47、0.23、0.11 L/mL；待培养基凝固后，用移液枪吸取

17、200 L 菌悬液，均匀涂布于固体培养基表面 7。以不长菌时的山苍子精油的体积浓度来确定山苍子精油抑菌的最低体积浓度为山苍子精油的 MIC 值，以丙三醇无菌水作对照。1.2.6热处理对山苍子精油抑菌活性的影响将山苍子精油分别于40、60、80、100下热处理10 min，取出后立刻置于冰浴中冷却待用；10 mL含1/2 MIC山苍子精油浓度的无菌培养基冷却待用；待培养基冷却后，取200 L菌悬液均匀涂布在平板上，以等量无菌水涂布作为空白对照，按1.2.3的条件进行培养，每个菌种做三组平行取均值。1.2.7pH值对山苍子精油抑菌活性的影响利用磷酸缓冲液来调制不同pH值的培养基，pH值梯度浓度分别

18、为3.5、4.5、5.5、6.5、7.5；山苍子精油与无菌培养基混匀使得培养基中山苍子精油的浓度为1/2 MIC，冷却后取200 L菌悬液均匀涂布在平板上，以等量无菌水涂布作为空白对照，按1.2.3的条件进行培养，每个菌种做三组平行取均值。2结果与分析2.1山苍子精油的含量按1.2.1进行水蒸气蒸馏测得山苍子干果粉末中山苍子精油平均含量为3.28%。2.2山苍子精油的主要成分 水蒸气蒸馏法提取得到的山苍子精油利用 GC-MS 法进行成分分析，其TIC见图1，主要化学成分鉴定出 23种物质详见表1，其中柠檬醛的含量为74.07%（橙花醛：38.57%；香叶醛：35.50%），高于赣南产山苍子油的

19、68.43% 10。图1 水蒸气蒸馏法提取的山苍子精油的TIC表1 湘西永顺产山苍子精油的化学成分NO. 化合物名称 分子式 百分含量/%1 -蒎烯 C10H16 1.152 莰烯 C10H16 0.473 桧烯 C10H16 0.414 -蒎烯 C10H16 0.805 6-甲基-5庚烯-2酮 C8H14O 1.146 -月桂烯 C10H16 1.517 柠檬烯 C10H16 6.528 桉树脑 C10H18O 1.419 芳樟醇 C10H18O 1.7610 5-甲基 -2-异丙烯基-4-己烯醛 C10H16O 0.2511 香茅醛 C10H18O 2.2012 龙脑 C10H18O 0.

20、0813 -松油醇 C10H18O 0.63141,3,4-三甲基-3-环己烯基1-甲醛C10H16O 1.2015 橙花醇 C10H18O 0.7016 橙花醛 C10H16O 38.5717 香叶醇 C10H18O 1.0118 香叶醛 C10H16O 35.50193,7-二甲基 -2,3-环氧基-6-辛烯醇C10H18O2 0.1820 -榄香烯 C15H24 0.3221 1-石竹烯 C15H24 1.152223-丁子香烯氧化石竹烯C15H24C15H24O其它0.180.322.542.3平板计数的结果与分析 山苍子精油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白曲霉和青霉的抑菌活性如表2所示

21、。结果表明，添加了丙三醇的平板培养基上，四种菌都长出了菌落，且生长情况良好；而添加了山苍子精油的平板培养基上均未有菌落生长，可见山苍子精油对四种菌都表现出了有效的抑制作用。表2 山苍子精油的抗菌活性实验菌株 平行1 平行2 平行3 空白大肠杆菌 - - - +金黄色葡萄球菌 - - - +白曲霉 - - - +青霉 - - - +注：“+”表示平板上有菌落生长，“- ”表示平板上未长出菌落。2.4山苍子精油最低抑菌浓度的结果与分析山苍子精油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白曲霉和青霉的最低抑菌浓度（MIC ）如表3所示。表3 山苍子精油对霉菌和细菌最低抑菌浓度山苍子油浓度/L.mL -1实验菌株3

22、0 15 7.5 3.75 1.88 0.94 0.47 0.23 0.11大肠杆菌 - - - - - + + + +金黄色葡萄球菌 - - - - - - + + +白曲霉 - - - - - - + + +青霉 - - - - - - - + +注：“”表示平板上有菌落生长，“-”表示平板上未长出菌落。山苍子精油对霉菌抑菌效果优于细菌。山苍子油对青霉、白曲霉的最小抑菌浓度（MIC）分别为0.47、0.94 L/mL。山苍子精油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度( MIC) 分别为1.88、0.94 L/mL，对细菌的抑菌结果与吴均等 7的实验结果有些许差异，可能由于山苍子精油中柠檬

23、醛含量差异所致。2.5热处理对山苍子精油抑菌活性的影响不同温度热处理后的山苍子精油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白曲霉、青霉四种菌的抑菌活性如表4所示。表4 不同温度处理后山苍子精油对实验菌种菌落数的影响 不同温度处理后菌落数/ 个实验菌株40 60 80 100大肠杆菌 103 103 110 120金黄色葡萄球菌 20 22 23 30白曲霉 0 0 1 1青霉 16 18 24 25从表4可以看出，当热处理温度在4060区间时，温度对山苍子精油抗菌活性影响不大，而热处理温度在60100区间时，温度升高使山苍子精油中有效抑菌活性物质挥发或发生裂解，导致山苍子精油抑菌活性有所下降。2.6pH值

24、对山苍子精油抑菌活性的影响不同pH值条件下山苍子精油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白曲霉、青霉四种菌的抑菌活性如表5所示。表 5 不同pH值条件下山苍子精油对对实验菌种菌落数的影响不同pH值条件下的菌落数 /个实验菌株3.5 4.5 5.5 6.5 7.5大肠杆菌 82 90 100 110 115金黄色葡萄球菌 17 19 21 24 26白曲霉 1 1 0 0 0青霉 19 19 20 19 21由表5可知，在pH值为3.57.5的条件下，山苍子精油对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌活性的影响较大，pH值越小山苍子精油的抑菌效果越好；但对白曲霉和青霉而言，不同pH值对山苍子精油的抑菌活性影响不大

25、，可能是霉菌相对于细菌来说更易在酸性环境下生存。由此可知当pH 值在3.57.5的范围内， pH值越小山苍子精油抑菌效果越好，而pH值对山苍子精油抑霉菌活性影响不大。3结论本文采用水蒸气蒸馏法对湘西永顺产的新鲜山苍子果实进行提取，其山苍子精油含量为3.28%。利用气相色谱-质谱法分析鉴定出湘西永顺产山苍子精油的主要化学成分有23种，其中柠檬醛含量为74.07% （橙花醛：38.57%；香叶醛：35.50%）。山苍子精油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白曲霉、青霉四种菌的最低抑菌浓度（MIC）分别为1.88 、0.94、0.94、0.47 L/mL。山苍子精油能抑制细菌和霉菌的生长。当热处理温度在4

26、0100区间时，温度导致山苍子精油的抑菌活性有所下降；当pH 值在3.57.5的范围内，pH值越小山苍子精油的抑菌效果越好，而pH值对山苍子精油抑霉菌活性的影响不大，具体抑菌机理有待于进一步探讨。参 考 文 献1 陈根洪，程超. 山苍子油提取与微胶囊化研究J. 中国粮油学报， 2005，20（5）：108-1101 CHEN Genhong, CHENG Chao. Extraction and micro-encapsulation of listea cubeba oilJ. Journal of the chinese cereals and oils association, 2005

27、, 20(5): 108-1102 CHEN Hsinchun, CHANG Wente, HSEU Youcheng, et al. Immunosuppressive effect of litsea cubeba l.essential oil on dendritic cell and contact hypersensitivity responsesJ. International journal of molecular sciences, 2016, 17(8):13193 LIU Taiti, Yang Tsungshi. Antimicrobial impact of th

28、e components of essential oil of litsea cubeba from taiwan and antimicrobial activity of the oil in food systemsJ. International journal of food microbiology, 2012, 156(1):68-754 ANIL KUMAR Saikia, DIPAK Chetia, MANUELA Darrigo, et al. Screening of fruit and leaf essential oils of litsea cubeba pers

29、. from north-east indiachemical composition and antimicrobial activityJ. Journal of essential oil research, 2013, 25(4):330-3385 余伯良,吴仕业. 山苍子油对花生酱的防霉保鲜效果J. 中国粮油学报，1998，13（4）：49-525 Yu Boliang, Wu Shiye. The Preservative effect of the seed-oil of litsea cubeba on peanut butterJ. Journal of the chines

30、e cereals and oils association, 1998, 13(4): 49-526 李文茹，施庆珊，莫翠云，等. 几种典型植物精油的化学成分与其抗菌活性 J. 微生物学通报，2013，40(11)：2128-21376 LI Wenru, SHI Qingshan, MO Cuiyun, et al. Chemical composition and antimicrobial activity of several typical essential oilsJ. Microbiology china, 2013, 40(11): 212821377 吴均，杨钦滟，赵晓娟，等. 山苍子油的抑菌活性及机理研究 J. 食品工业科技，2013，34(17)：119-121 ，125