正交试验法综合优选附子高压炮制工艺.DOC

1、正交试验法综合优选附子高压炮制工艺方 莉 2，林 华 1，邓广海 1，龚又明 1（1.广东省中医院 药学部，广东 广州 510120；2.广州中医药大学，广东 广州 510405）摘要 目的：优选附子高压蒸制的最佳工艺。方法：以其含生物碱的含量和传统外观质量为综合指标，采用 L9(34)正交试验法，对高压蒸制时间、压力及软化方式三个因素进行考察。结果：附子最佳高压蒸制工艺为：A 2B2C2，即附子经润湿法处理后，0.10 Mpa 压力下蒸制 150 min，即得。结论：该方法简便易行可控，可作为代替附子传统炮制工艺的新方法。关键词 附子；高压蒸制；正交设计；双酯型生物碱；单酯型生物碱；总生物碱

2、The Study of Pressurized Steaming Technologyof Radix Aconiti by Orthogonal TestFang Li2, Lin Hua1*, Deng guanghai1,Gong youming1(1.Pharmaceutical Department, Guangdong Provincial Hospital of TCM, Guangdong, Guangzhou, 510120, China; 2.Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine, Guangdong,

3、Guangzhou,510405, China)Abstract Objective: To optimize the best method of processing under high steaming pressure of Radix aconiti. Methods: Orthogonal test was used to study the effect of the three factors including processing time、processing pressure and processing mode, and the content of six ki

4、nds of alkaloids and total alkaloids was determined to evaluate the processing technology steaming under high pressure of Radix aconiti. Results: Processing technology was optimized as A2B2C2, the method of cutting after moistening, and steamed for 150 min at 0.10 Mpa. Conclusion: This method was si

5、mple, practical and easy to control, could be used as a new method, insteading the traditional processing technology.Key words Radix aconiti; Steaming under high pressure; Orthogonal design; Diesterifiable alkaloids; Monoester alkaloids; Total alkaloids基金项目 广东省科技厅课题 (2009B030801300)通信作者 林华，硕士，主任中药师，

6、研究方向：中药质量控制和安全性评价，Tel:13600468665 E-mail:。方莉，硕士生，方向：中药质量控制和安全性评价，Tel:15920450369, E-mail:。附子为毛茛科植物乌头(Aconitum carmichaeli Debx) 的干燥子根，为温中回阳救逆之要药，其功效被历代医家所首肯。但附子生品有大毒，其中所含的乌头碱等酯型生物碱既是有效成分，也是毒性成分，且安全范围较小，有效的炮制可以使双酯型生物碱水解为单酯型生物碱，达到降毒存效的效果。若炮制不及，则毒性太大，若炮制太过，则药效不存。目前还没有能够同时控制毒性和保证疗效的炮制工艺规范，也没有能够表明附子安全性和有

7、效性的科学、量化的质量标准，造成各地附子炮制品的质量相差很大 1。附子的药典法制方法为常压蒸法和煮法相结合 2，该方法耗时耗能，需要以炮制人员凭借长期炮制附子的经验判断炮制终点，不能达到参数化的可控性，且炮制过程中有效成分损失严重。传统上是在产地进行洗净、泡胆巴、煮、剥皮、切片、漂片、蒸片、烤片等处理，在此过程中，附子中生物碱流失达 81.3%，其中泡胆巴 31.6%，漂片 33.6%，蒸片 16.1% 3。高压蒸制法由于其操作简单、可控、省时，且去毒效果好，是现代研究的热点。本研究参考川乌高压炮制工艺 4，采用 L9(34)正交表对高压蒸制的主要因素进行考察，多指标优选附子最佳烘制工艺，为建

8、立一个省时高效的炮制方法提供依据。1 仪器与试药Agilent-1200 高效液相色谱仪（DAD 检测器、自动进样器、在线脱气、四元泵） 、KQ-300VDB 型数控超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司） 、BS210S 型电子天平（北京赛多利斯公司） 。苯甲酰新乌头原碱（111795-200901 ） 、苯甲酰乌头原碱（111794-200901 ）购买于中国药品生物制品检定所（纯度98.0%） ，乌头碱（批号 W-006-110321） 、新乌头碱（批号 X-011-110425） 、次乌头碱（批号 C-023-110822）对照品和苯甲酰次乌头原碱对照品（B-016-110916）由成都瑞

9、芬思生物科技有限公司提供（纯度98.0% ） ；乙腈、四氢呋喃均为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为超纯水。附子药材（康美药业股份有限公司提供） ，经广东省中医院主任中药师林华鉴定为毛茛科植物乌头 Aconlium Carmiehaeli Debx.的干燥子根盐制品，即盐附子。2 方法与结果2.1 附子高压蒸制工艺和含量测定的方法学考察据相关炮制资料的研究，确定附子的水处理所用胆巴使用量与药材的比例为 1:25，在预实验的基础上，选择高压压力、蒸制时间和水处理方式为主要考察因素，每个因素设立3 个水平，以传统外观性状、工艺的生产性难易程度和生物碱的含量为评价指标，以归一化的方式计算综合评分，进行

10、 4 因素 3 水平的 L9(34)正交试验，对试验结果进行复查分析，优选出最佳的高压蒸制工艺。2.1.1 6 种酯型生物碱的含量测定色谱条件：美国安捷伦公司 Agilent Eclipse XDB-C18 分析柱（4.6 mm250 mm,5 m） ；流动相乙腈-四氢呋喃 25:15(A)0.1% mLmin-1 醋酸铵（1000 mL 加冰醋酸 0.5 mL） (B)；流速 0.8 mLmin-1；检测波长 235 nm；柱温 30 ；理论塔板数 6 种生物碱均不低于 3000。对照品溶液制备：分别精密称取新乌头碱 2.37 mg、乌头碱 2.04 mg、次乌头碱 1.61 mg、苯甲酰新

11、乌头原碱 4.02 mg、苯甲酰乌头原碱 3.04 mg、苯甲酰次乌头原碱 3.19 mg 置于 10 mL 的容量瓶中，加入 0.05%盐酸-甲醇液，稀释至刻度，摇匀，得混合对照品 a 溶液，然后精密移取该溶液 1.0 mL 置于 10 mL 量瓶中，用 0.05%盐酸-甲醇液稀释至刻度，摇匀，得混合对照品 b 溶液。供试品溶液制备：分别取附子生品及其炮制品粉末（50 目）1.0 g 和 2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入氨试液 3 mL 与异丙醇- 乙酸乙酯（1:1）混合溶液 50 mL，摇匀，称重，放置 16 h，连续超声 30 min，冷却，称重，用混合溶液补足减失重量，摇

12、匀，滤过，精密移取续滤液 25 mL，40以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入 0.05%的盐酸- 甲醇溶液 5 mL 溶解，摇匀，过 0.45 m 滤膜，取续滤液，即得。标准曲线的制备：精密吸取混合对照品 a 溶液 2，4，6，8，10，12，16，20 L，混合对照品 b 溶液 1，2，4，6，8，10 L，按照上述色谱条件，测定，以各生物碱对照品的进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，得标准曲线。为了更准确地测定含量，绘制高低浓度标准曲线，并计算回归方程，结果见表 1。表 1 标准曲线方程及线性关系Table 1 The linear regression equation of six kin

13、ds of alkaloids对照品名称 线性范围(g) 标准曲线 相关系数（R 2）新乌头碱 0.019990.19990 y = 1086.33507 x + 1.44858 0.999980.399843.99840 y = 1096.86493 x - 45.59456 0.99990次乌头碱 0.020190.20190 y = 1127.08640 x + 1.69972 0.999960.403764.03760 y = 1161.65740 x - 59.82194 0.99991乌头碱 0.020190.20190 y = 991.17009 x + 3.41473 0.99

14、991 0.403764.03760 y = 955.29378 x - 38.30182 0.99994苯甲酰新乌头原碱 0.029990.29990 y = 903.21571 x + 2.40132 0.999990.599745.99740 y = 895.22524 x - 19.48251 0.99997苯甲酰乌头原碱 0.029890.29890 y = 865.00744 x + 2.34650 0.999950.059780.59780 y = 841.21006 x + 8.20396 0.99990苯甲酰次乌头原碱 0.029890.29890 y = 1000.4189

15、5 x + 2.13646 0.999950.059780.59780 y = 976.83939 x + 12.77711 0.99984精密度试验：精密吸取含 6 种生物碱的混合对照品 b 溶液，重复进样 5 次，每次 10 mL，计算含量。结果新乌头碱、乌头碱、次乌头碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱和苯甲酰次乌头原碱的 RSD 分别为 0.7%，0.7%，0.7% ，1.4% ，0.9%和 0.9%（n=5） ，表明精密度良好。稳定性试验：精密称取同一批号的附片药材 1 g，按照上述供试品制备方法制备成供试品溶液，在上述色谱条件下进行分析，分别在 0，4，8，16，24h 进样 10

16、 L。结果表明，供试品人溶液中 6 种生物碱的峰面积的 RSD 分别为1.2%， 1.5%， 2.6%，1.0%， 0.9%，2.0%（n=5 ） ，供试品溶液在 24 h 内稳定。重复性试验：精密称取同一批号的附片 5 份，依上述供试品溶液制备方法制备和上述条件测定，计算含量。结果 6 种生物碱的 RSD 依次分别为 1.8%，1.6%和 3.3%，1.9% ，2.1%和2.4%，表明本方法重复性良好。加样回收率试验：取生附片药材粉末 5 份约 0.5 g，精密称定，分别置于具塞锥形瓶中，各精密加入新乌头碱、乌头碱等 6 种对照品适量，按供试品制备方法制备成供试品溶液，在上述色谱条件下进行测

17、定，计算回收率。结果表明，新乌头碱的平均回收率为101.3%(RSD2.2%)；次乌头碱的平均回收率为 97.9%(RSD2.8%)；乌头碱的平均回收率为99.9%(RSD2.9%)；苯甲酰新乌头原碱的平均回收率为 96.8%(RSD2.9%)；苯甲酰乌头原碱的平均回收率为 98.4%(RSD2.7%)；苯甲酰次乌头原碱的平均回收率为 101.2%(RSD2.5%)(n=5)，表明该测定方法测定结果准确可靠。样品含量测定：按照上述含量测定方法，测定附子生品及其炮制品中新乌头碱、次乌头碱、乌头碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱的含量。2.1.2 总生物碱的含量测定按照 201

18、0 年版中国药典一部 2附子项下总生物碱含量测定方法即滴定法进行测定，选择甲基红指示剂指示滴定终点。2.2 正交设计法附子高压蒸制工艺的优选2.2.1 附子软化方式 （1）润湿法：取大小均匀的生附子，除去杂质，置于密闭容器中，喷洒适量的胆巴溶液，使药材全部湿润，润 0.5 h 并拌润。 （2）润透法：取大小均匀的生附子，除去杂质，置于密闭容器中，喷洒适量的胆巴溶液，使药材全部湿润，底部不积水为度，上盖胆巴溶液浸湿的脱脂棉，每隔 1 h 拌润 1 次，至个大药材切开内无干心。 （3）不换水浸泡法：取大小均匀的附子，除去杂质，置于密闭容器中，加入胆巴溶液使其盖过药面 12 cm，不换水浸泡至个大药

19、材切开内无干心。2.2.2 高压蒸制附子的炮制取大小均匀的生附子样品 9 份，每份 500 g，按附子高压蒸制工艺因素水平表（表 2）给定的条件，用相应的水处理方式、蒸制温度和时间炮制，取出，晾凉，进行传统外观质量评分，并对其生物碱的含量进行测定。表 2 附子高压蒸制工艺因素水平表Table 2 High pressure steaming process factors and levels table for Aconite水平 因素炮制时间（A） 压力（B） 处理方式（C）1 90 min 0.07 Mpa 润透法2 150 min 0.10 Mpa 润湿法3 180 min 0.15

20、Mpa 不换水浸泡法2.2.3 综合评分值的确定 本实验对各指标进行多指标综合评价，评分时以各指标的最大值为参照将数据归一化，再给出不同的权重。双酯型生物碱毒性最强，在炮制的过程中，转化为低毒单酯型生物碱和其他生物碱，给予权重 50%；总生物碱的含量总体标志着含量的高低，故给予权重 35%；外观可以反映一定的内在质量，权重 15%。综合评分=双酯型生物碱总含量评分50总生物碱含量评分35炮制品外观评分评分15，满分为1.00。结果见表 4。表 3 药材炮制品的外观评分标准Table 3 The standards for evaluation the products appearance 项

21、目 评分（单位：分）10 7 5 1色泽 乌黑发亮 黑褐色 皮部黄褐色、木部黄白色 黄白色质地 质地实、酥脆 质地实、较为酥脆 质较坚实，略呈粉性 质硬呈粉性断面光泽 断面较有光泽 断面略有光泽 断面粗糙气味 气微，无麻舌感 气微，微有麻舌感 气微，有麻舌感 气微，麻舌感强烈表 4 L9(34)正交试验法含量测定结果Table 4 The results of L9 (34) orthogonal test 序号 时间 压力 处理方式 空列 y1 y2 y3 综合评分（A） （B） （C） （mgg -1） （mgg -1） 1 1 1 1 1 0.1005 9.0 4 0.41822 1 2

22、 2 2 0.0305 8.6 8 0.78243 1 3 3 3 0.0714 7.8 9 0.58354 2 1 2 3 0.0495 8.3 8 0.68555 2 2 3 1 8.1 9 0.91856 2 3 1 2 0.0272 7.8 9 0.78467 3 1 3 2 0.0518 7.4 8 0.64358 3 2 1 3 8.5 9 0.93259 3 3 2 1 0.0345 7.9 9 0.7547K1 1.7840 1.7472 1.8584 1.8464 Xi=6.5034K2 2.3886 2.6334 2.3444 2.4004 CT=(Xi)2/n=4.699

23、3 K3 2.3307 2.1227 2.3005 2.2566 k1 0.5947 0.5824 0.6195 0.6155k2 0.7962 0.8778 0.7815 0.8001k3 0.7769 0.7076 0.7668 0.7522极差 R 0.2015 0.2954 0.1620 0.1846 注：y1，y2 分别表示双酯型生物碱和总生物碱的含量，y3 为外观评分。2.2.4 实验结果分析将正交试验结果进行方差分析。结果见表 5。表 5 方差分析结果Table 5 The results of variance analysis 来源 平方和 S 自由度 f 均方和 S/f F

24、 值 显著性A 0.074 2 0.037 25.297 *B 0.132 2 0.066 44.988 *C 0.002 2 0.001 0.518 误差 E 0.003 2 0.001总和 4.910 9 *注：F 0.05（2,9） =4.26；F 0.1（2,9） =8.02方差分析结果表明，影响附子高压炮制的因素的主次顺序为：B(炮制压力)A( 炮制时间) C(处理方式)，因素 A(炮制时间 )和 B(炮制压力) 具有显著性差异。经综合分析确定附子高压炮制的最佳工艺为 A2B2C2，即附子经润湿法处理后，于 0.10 Mpa 压力下炮制 150 min，即得。2.5 工艺的验证及炮制

25、前后生物碱含量比较取大小均匀附子各 3 份，每份 500 g，按照上述 A2B2C2 最佳的工艺进行炮制，然后测定其 6 种生物碱和总生物碱的含量。结果见表 6。表 6 附子炮制前后生物碱含量比较（单位：mgg -1）Table 6 The comparison of levels before and after concocting (unit: mg g-1)名称 苯甲酰新 苯甲酰 苯甲酰次 总单酯型 新乌 次乌 乌头碱 总双酯型 总生乌头原碱 乌头原碱 乌头原碱 生物碱 头碱 头碱 生物碱 物碱生附子 0.6033 0.0464 0.1074 0.7570 0.2806 0.4576

26、0.0351 0.7733 10.3875 高压蒸制附子 0.9720 0.1980 0.1819 1.3519 0.0584 0.0584 8.2107表 6 结果表明，附子生品主要含有双酯型生物碱和单酯型生物碱，经高压蒸制法处理后，其双酯型生物碱大大降低，单酯型生物碱明显增加，总生物碱的含量则变化不大。A B C Figure 1 Determination by HPLC of Raw aconite and high-pressure steamed aconite.A 6 种生物碱混合对照品；B 生附子；C 高压蒸制附子1.苯甲酰新乌头原碱；2.苯甲酰乌头原碱；3.苯甲酰次乌头原碱；

27、4.新乌头碱；5.次乌头碱；6.乌头碱图 1 附子生品及高压蒸制品的含量测定 HPLC 图3 讨论新版药典中收载了 3 种炮制规格的附子及 1 种利于储藏的附子保存方式盐附子，这三种规格的附子，分别为黑顺片、白附片和炮附片，功效均以温肾壮阳、填补命门之火为主，但在临床上各有侧重，黑顺片与白附片回阳救逆、散寒止痛，炮附子以温肾暖脾为主 9。本实验将黑顺片蒸煮的炮制方式更改为高压蒸制方式，得到的附子加工品与药典规定的黑顺片相比，在外观上有极大的相似度，在含量上均符合药典的规定，可考虑作为黑顺片的替代炮制方式 10。本实验所设计的不同炮制条件下制得的附片均能测得六种生物碱，但其含量在一定范围内随炮制

28、压力的升高而变化，相关性表现为双酯型生物碱和总生物碱负相关，单酯型生物碱正相关；炮制时间对附子炮制有直接的影响，实验研究发现，同一炮制条件高压制附子双酯型生物碱的总量随蒸制时间延长而降低。因此，平衡好压力和时间参数是炮制工艺的关键。同时本实验还对其水分量进行测定，以科学的评价高压蒸制工艺对其酯型生物碱水解含量的影响。研究文献资料发现，酯型生物碱在水存在条件下，其水解比较完全 11，而 3 种软化方式处理后，保留一定的水分，有利于水解作用。验证结果表明，该工艺的重复性较好，具有一定的可行性。含量测定结果显示，总双酯型生物碱和总单酯型生物碱的含量均落在药典的限量范围内。与传统的蒸煮工艺相比，该方法

29、在一定程度上节约时间和资源，且需要的设备较简单；本质上该方法实现了附子饮片的参数化炮制，具有一定的现实和生产意义。一般认为，附子中的这六种生物碱具有强心、镇痛的作用，但附子经炮制后，单酯型生物碱含量的提高与双酯型生物碱的降低是否能促进附子回阳救逆的功效 12，以及附子高温炮制后的作用机制还有待进一步的研究 13。此外，该炮制工艺改进较大，为了保证其安全性和有效性，还需进行毒理学和药理学的研究。参考文献1 王瑞，刘芳等 .不同附子炮制品中乌头碱、新乌头碱、次乌头碱含量的 HPLC 测定J. 药物分析杂志,2006,(10):1361-1363.2 中国药典S.一部. 2010:36-38.3 冉

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