山茱萸总苷的提取和大孔吸附树脂分离纯化工艺考察.DOC

1、【收稿日期】2012-8-16【基金项目】国家自然基金“从调控骨钙素分泌研究六味地黄丸干预 2 型糖尿病的作用机制” （30901988） ；天津市高等学校科技发展基金计划项目 “山茱萸血中移行成分调节MSCs 脂向/骨向分化平衡机制研究” （20110206）【第一作者】宋春敬，硕士，实验师，主要从事中西医结合研究，Tel：022-595962811，Email：【通讯作者】王艳，硕士，讲师，主要从事中药炮制学和中药药理学研究，Tel：022-59596235，Email：山茱萸总苷的提取和大孔吸附树脂分离纯化工艺考察宋春敬 1，王艳 1，于顺禄 2，王慧明 3（1.天津中医药大学中药学院天

2、津市中药化学与分析重点实验室， 天津 300193；2.天津市天津医院，天津 300211；3.天津中医药大学第一附属医院，天津 300193）【摘 要】：目的：研究山茱萸中总苷的最佳提取工艺及大孔树脂纯化工艺。方法：以山茱萸干燥成熟果实为材料提取山茱萸总苷，莫诺苷含量为评价指标，选择乙醇浓度、料液比、提取时间、提取次数为考察因素，采用单因素和正交试验优选提取工艺，并进行验证试验。采用最佳工艺提取后，上HPD-300型大孔吸附树脂，水洗后分别用10%，30%，50%，70%的乙醇洗脱，考察大孔树脂富集、纯化山茱萸总苷的吸附性能和洗脱参数。结果：50%乙醇是山茱萸总苷的最佳提取溶剂，提取次数对山

3、茱萸总苷含量的影响最显著。大孔吸附树脂纯化过程中山茱萸总苷富集于30%乙醇洗脱液部分，洗脱流速为1.5 BVh-1，洗脱剂用量为3 BV，洗脱率达94.9%。结论：山茱萸中山茱萸总苷的最佳提取工艺是50%乙醇提取， 料液比18， 提取时间3 h， 提取次数3次。采用大孔吸附树脂可较好地纯化山茱萸总苷。【关键词】：山茱萸; 总苷; 正交实验；提取工艺；大孔吸附树脂Study on extraction and purification of cornus officinalis saposins with macroporous resinSong Chun-jing1，Wang Yan 1，Y

4、u Shun-lu 2，Wang Hui-ming 3(1.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2. TianJin Hospital，Tianjin 300211，China；3.First Teaching Hospital of Tianjin University of TCM )Abstract Objective: This study aimed to optimize the extraction techniques and explore the best condi

5、tion for separating and purifying cornus officinalis saposins by macroporous resin. Method: Cornus officinialis saposins were extracted from dry and ripened cornel and the content of morroniside was used as an evaluation index. The factors that we considered to optimize during extraction were ethano

6、l concentration， ratio of material， extracting time and extracting times. Specifically， we used single-factor test， orthogonal test and verification experiment to get the optimal extraction condition. After extracted by the optimal procedure， the cornus officinialis saposins were then purified with

7、HPD-300 macroporous resin and finally eluted with 10%， 30%， 50% and 70% ethanol after washed by water. The parameters for adsorption and elution of cornus officinialis saposins that was enriched and purifed by macroporous resin were recorded. ResuLt : We showed that 50% ethanol had a better adsorpti

8、on property for cornus officinialis saposins and extracting times also had an obvious affection on the content of cornus officinialis saposins. The favorable parameters for purification of cornus officinialis saposins by macroporous sorptive resin are: the elute rate 1.5 BVh-1， the elute volume 3 BV

9、 and the elution efficiency 94.9%. The cornus officinialis saposins were enriched in 30% ethanolic extractive. Conslusion: The optimal extracting parameters for cornus officinialis saposins were as followings: 50% ethanol， the ratio of material to water 1:8， extraction for 3 times in 3 hours. It was

10、 also s ggested that adsorption by macroporous resin was an efficient way to isolate and purify cornus officinialis saposins. Key words cornus officinalis saposins; orthogonal test; extraction process; macroporous resin山茱萸为山茱萸科植物山茱萸( Cornus offoconalis Sieb. et Zucc.)的干燥成熟果肉，其味酸、涩，性微温，为传统的收敛性药，具有补益肝

11、肾，收涩固脱之功效。用于眩晕耳呜，腰膝酸痛，阳痿遗精，遗尿尿频，崩漏带下，大汗虚脱，内热消渴 1。山茱萸的总苷成分有环烯醚苷类和皂苷类成分（五环三萜酸及其酯类） ，近代研究表明环烯醚萜苷类为山茱萸中主要有效部位，具有抗心率失常 2、保护脑缺血损伤 3、降血糖 4、治疗骨质疏松症 5-8等广泛的药理作用。莫诺苷(morroniside)属环烯醚萜苷类，为山茱萸中主要药效成分，含量较高 9，具有预防糖尿病性血管病的作用 10。本实验以莫诺苷为指标成分，采用单因素和正交试验对山茱萸总苷的提取工艺进行了优选，以期最大程度地提取其中的药效成分，并通过考察HPD-300型大孔树脂富集、纯化山茱萸药材中总苷

12、的工艺条件与工艺参数，从而确立富集、纯化山茱萸总苷的可行方法，为工业化生产提供参考依据。1 仪器与材料1.1 仪器：美国CoMetro 6000高效液相色谱仪（天津市深航科技仪器有限公司） ；Hypersil C18色谱柱（大连依利特分析仪器有限公司） ；上海精科FN1004N分析天平；H1650高速台式离心机；天津奥特赛思斯20500超声仪。1.2 药材及试剂：山茱萸药材购于河北安国药市，经天津中医药大学马琳教授鉴定为山茱萸科植物山茱萸( Cornus offoconalis Sieb. et Zucc.)的干燥成熟果肉，50干燥备用；莫诺苷，纯度98%（天津马克生物技术有限公司） ；其他试

13、剂均为分析纯或色谱纯；HPD-300型大孔吸附树脂(河北沧州宝恩化工有限公司)。2 方法与结果2.1 莫诺苷的含量测定2.1.1 色谱条件与检测方法 色谱柱：Hypersil C18柱（4.6 mm200 mm） ；流动相：甲醇-0.1%冰醋酸（20：80） ；检测波长：240 nm，柱温：40；流速：1.0 mLmin -1；进样量：10 L。2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取莫诺苷对照品，加 80%甲醇制成 0.216 mgmL-1的溶液，0.45 m 微孔滤膜滤过即得。2.2.3 供试品溶液的制备 取山茱萸粉末(过三号筛)约 0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入 80甲醇

14、25 mL，称定重量，加热回流 1 h，放冷，再称定重量，用 80甲醇补足减失的重量，摇匀，0.45m 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。2.2.4 线性关系的考察 精密吸取对照品溶液，用80%甲醇稀释成0.00337，0.0135，0.0270，0.108，0.216 mgmin-1的溶液。精密吸取上述不同浓度的对照品溶液各10 L，按 2.1.1色谱条件测定峰面积。以对照品量(g)为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，得回归方程为Y=8390.4x +25808，r=0.9999。结果表明，莫诺苷在0.033732.16 g呈良好的线性关系。2.2.5 精密度实验 取山茱萸生品粗粉，按供试品溶液制备

15、方法制备，在上述色谱条件下，重复进样 6 次，测得莫诺苷峰面积 RSD0.76。表明莫诺苷精密度良好。2.2.6 稳定性试验 取山茱萸生品溶液分别在 0，2，4，6 ，8，10 ，24 h 进样，测定峰面积积分值，计算莫诺苷 RSD 值为 1.62%。结果表明莫诺苷在 24 h 内稳定性良好。2.2.7 重复性实验 取同一山茱萸生品粗粉 6 份各约 0.1 g，精密称定，按照 2.2.3 供试品溶液制备方法制备，进样，测定莫诺苷的含量，分别为1.60%，1.71%，1.65%，1.73%，1.69%，1.66%，平均含量为 1.67%，RSD 为 2.55%（n=6） 。结果表明此法重复性良好

16、。2.2.8 加样回收实验 取已知含量的山茱萸粉末约 0.05 g，精密称定，加入莫诺苷对照品适量，按供试品溶液制备方法制备，测定其含量,并计算回收率，结果见表 1。结果表明此法加样回收率良好。表 1 莫诺苷加样回收率试验结果(n=6)编 称样量 样品值 加入量 测得值 回收率 平均回收率 RSD号 （g） （mg） （mg） （mg） （%） （%） （%）1 0.0532 0.9006 1.04 1.962 102.12 0.0521 0.8821 1.04 1.938 101.53 0.0540 0.9142 1.04 1.986 103.1 101.2 2.684 0.0502 0.8

17、498 1.04 1.94 104.85 0.0515 0.8719 1.04 1.901 99.06 0.0541 0.9159 1.04 1.921 96.62.2 山茱萸总苷提取工艺优化2.2.1 提取溶剂的选择 称取山茱萸药材2g，选用蒸馏水和30%，50%，70%，95%的乙醇作为提取溶剂，料液比1：10，回流提取4h，过滤并离心，取上清液50%乙醇定容至50 mL量瓶中，分别吸取2 mL，于水浴上蒸干， 80%甲醇溶解并定容至 25 mL量瓶中，得供试品溶液。0.45 m微孔滤膜滤过，按 2.1.1色谱条件进样，测定莫诺苷含量。结果见表1。由表1 可知， 用乙醇作为溶剂提取山茱萸中

18、总苷，醇提液中莫诺苷含量明显高于水提液， 其中50%乙醇提取液莫诺苷含量最高， 故以50%乙醇作为山茱萸总苷的提取溶剂。表1 不同提取溶剂对山茱萸中莫诺苷含量的影响溶剂 莫诺苷含量（mgg -1）蒸馏水 10.8830%乙醇 11.9050%乙醇 13.0070%乙醇 12.1095%乙醇 11.192.2.2 正交试验设计方案 选择料液比（A） 、提取时间（B） 、提取次数（C）作为参考因素，以莫诺苷的含量作为评价指标，用L 9(34)正交设计表安排试验。所选因素水平见表2。表2 因素水平表因素 料液比（A） 提取时间（B） 提取次数(C)1 1:6 2 12 1:8 3 23 1:10 4

19、 32.2.3 正交试验供试品的制备与测定 称取山茱萸药材2g，根据表2按L 9(34) 正交设计表安排试验，用50%乙醇回流提取，过滤合并滤液，离心，取上清液50%乙醇定容至50 mL，分别吸取提取液2 mL，水浴蒸干， 80%甲醇溶解并定容至25 mL，0.45 m微孔滤膜滤过，按1.3.1色谱条件进样，以峰面积计算，得各组实验中莫诺苷含量。结果见表3，方差分析见表4。表3 正交试验设计表及结果试验号 料液比（A） 提取时间（B）回流次数(C) 空白（D）莫诺苷含量（ mgg -1）1 1 1 1 1 9.742 1 2 2 2 13.583 1 3 3 3 14.184 2 1 2 3

20、15.035 2 2 3 1 16.056 2 3 1 2 11.627 3 1 3 2 16.708 3 2 1 3 11.869 3 3 2 1 14.05K1K2K3R37.50042.69942.6095.19941.46941.49039.8471.64133.31942.66046.96913.71039.84041.90141.0702.061表4 方差分析表方差来源 偏差平方和自由度 差方 F值 显著性A 5.849 2 2.925 9.141 P0.05C 32.759 2 16.380 51.188 P0.01误差 1.280 4 0.32注：F 0.05（24）=6.94

21、0，F 0.01（24）=18.000由直观分析和方差分析的结果，可以得出山茱萸总苷的最佳提取工艺为A 2B2C3，即，料液比1：8，提取3h，提取3次。2.2.4 最优提取工艺验证实验 称取山茱萸5 g，按上述所得最佳工艺条件，验证3次，结果见表5，结果表明，验证试验结果与正交试验结果一致，在优化条件下山茱萸莫诺苷含量为16.08 mgg -1，RSD为0.87%，该提取工艺基本稳定。表6 验证实验结果样品 1 2 3 均值 RSD值（%）莫诺苷含量（mg/g）16.21 15.93 16.09 16.08 0.87%2.3 大孔树脂纯化工艺考察 2.3.1 上样量的确定 取经预处理的HPD

22、-300大孔树脂30 mL装柱，不断向树脂柱上样，收集下口流出液每6 mL接一馏份，按2.1.1色谱条件进样10 L，测定每份中莫诺苷的量，结果见图100.050.10.150.20.250.30.351 2 3 4 5 6 7 8馏 分 （ 每 份 6ml）莫诺苷（mg）图 1 HPD-300 泄漏曲线由图中可以看出，前 5 份中几乎无莫诺苷的泄漏，第 6 份为泄漏点，可确定 30 mL 树脂柱安全的上样量为 30 mL。料液浓度过高，与总苷竞争吸附的杂质量也随之增加，影响山茱萸总苷在树脂内部的扩散，因此上样液生药浓度为定为 0.025 gmL-1。.吸附量的计算：吸附量=（C 0-C）V/

23、W经计算得吸附量为 2.912 mgmL-1，即每毫升树脂吸附莫诺苷 2.912 mg。2.3.2 洗脱剂浓度的确定 分别配制 10%，30%，50%，70%的乙醇，依次用蒸馏水及各浓度乙醇溶液 2 BV 量梯度洗脱。收集各洗脱液 60 mL，测定莫诺苷的量。并计算解吸率绘制洗脱曲线，结果见图 2。由图 2 可知不同乙醇的洗脱曲线，30%的乙醇很快将目标成分洗净，解吸率达到 85%。故确定 30%的乙醇为洗脱剂。01020304050607080900 10 30 50 70醇 浓 度 （ %）解吸率（%）图 2 乙醇浓度与洗脱效果的关系2.3.3 洗脱速度的确定 平行装 4 个大孔树脂柱，上

24、样后用 100 mL 蒸馏水洗后，分别以 30%乙醇 120 mL，按 0.5 BV/h，1 BV/h，1.5 BV/h，2 BV/h 的流速洗脱并收集馏分，测莫诺苷的量。并计算解吸率，结果见图 3。由图 3 可知，流速对洗脱效果的影响比较明显。流速为 0.5 BV/h 时，解吸率为 85.3%；流速为 2 BV/h 时，解吸率只有 70.8%。原因可能是若流速过快，洗脱剂不能与被吸附的总苷充分作用而将其从树脂上洗脱出来。所以，洗脱流速在 0.51.5 BV/h 左右比较合适。因此选择 1.5 BV/h 为最佳洗脱流速。01020304050607080901000.5 1 1.5 2流 速

25、（ BV/h）解吸率（%）图 3 流速与洗脱效果的关系2.3.4 洗脱剂用量的确定 上样后用 100 mL 蒸馏水洗后，以 30%乙醇洗脱，收集洗脱液每 10 mL 为一馏分，测定莫诺苷的量。并计算解吸率，结果见图 4。由图 4 可知，当洗脱剂用量增加到 40 mL 时达到了最高的解吸率，当洗脱剂用量为 90 mL 时基本洗脱完全。因此，选用 90 mL（即 3 BV）洗脱剂进行洗脱，能够将目标成分洗脱完全。0510152025303540455010 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130洗 脱 剂 用 量 （ mL）解吸率（%）图 4 洗脱剂用量与洗

26、脱效果的关系2.3.5 纯化后含量测定 根据以上最佳条件，测定纯化后的总苷含量（以莫诺苷含量定） ，计算得洗脱液中莫诺苷的含量为 0.921 mg mL -1.以下为含量测定的色谱图M inutes0 2 4 6 8mV02550mV02550A 莫诺苷标准品25Minutes0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20mV020406080100120140mV020406080100120140Channel A - Absorbance_5a12.5品品.cdfAreaRetention TimeWidthNameB 山茱萸上样

27、液25Minutes0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20mV-30-20-100102030405060mV-30-20-100102030405060Channel A - Absorbance_5a品.cdfAreaRetention TimeWidthNameC 纯化后含量测定图 5 山茱萸 HPLC 谱图3 讨论试验分析认为，50%乙醇作为山茱萸总苷的最佳提取溶剂。根据直观分析和方差分析，最佳工艺条件为A 2B2C3，即，料液比1：8，提取3h，提取3次。此工艺简单易操作且成本较低，适合于工业生产。HPD-300大孔吸

28、附树脂对山茱萸总苷的吸附和解吸性能较好。最佳吸附条件为：料液浓度25 mgmL -1，流速1.5 BV/h，30%乙醇洗脱剂用量3 BV。总苷的提取方法有很多，有水浸法、甲醇回流法、大孔树脂法、乙醚脱脂-甲醇回流法、超声法、乙醇提取法等等。根据山茱英总苷特性，考虑到甲醇毒性较大，本试验采用乙醇回流法确定最佳工艺参数。大孔吸附树脂作为一种有效的分离手段，在中药有效成分的提取、分离、富集上得到运用，并取得了良好的实践效果 11。上样液有大量色素、粘液质、蛋白质、机械杂质等时，这些物质的存在大大降低了树脂的吸附能力，故上样液必须进行预处理，以提高树脂的饱和吸附量。本试验采用冷置后高速离心对上样液进行

29、预处理，不但能够除去部分色素、粘液质、蛋白质等，总苷几乎无损耗，且操作简便，更为适合工业化大生产。【参考文献】1 刘德军，路涛.山茱萸M. 北京：中国中医药出版社，2001：3.2 张兰桐，任雷鸣，温进坤.山茱萸抗心律有效部位的研究J.中草药，2001，32（11）：1004.3 李小黎，叶翠飞，张丽，等. 山茱萸环烯醚萜苷对脑缺血沙土鼠学习记忆能力和脑内神经营养因子的影响J.中华中医药学刊，2011，29(2)：263.4 时艳，许惠琴山茱萸环烯醚萜总苷对实验性糖尿病心脏病变的保护作用J 南京中医药大学学报，2006，22(1):35.5李平，李晶，王惠明. 山茱萸总苷对去势大鼠骨代谢和骨密

30、度影响的实验研究J.天津中医药，2008，24（4）：315.6李晶，王惠明.山茱萸总苷对去势大鼠骨代谢影响的生化研究J.辽宁中医杂志，2007，34（10）：1480.7王惠明，李晶，李平.山茱萸总甙对去势大鼠骨生物力学影响的实验研究J.吉林中医药，2007，27（6）：49.8李晶，武峻艳，王慧明，等.山茱萸总苷对去势大鼠骨组织形态学影响的实验研究J.上海中医药杂志，2010，44（480）：69.9 赵平，闫润红，刘养清，等. 栽培与野生山茱萸中马钱苷和莫诺苷含量分析J. 中国实验方剂学杂志，2009，15(4)：7.10 许惠琴，朱茎. 山茱萸环烯醚萜总苷对试验性糖尿病肾病变的保护作用J. 南京中医药大学学报，2003，19 (6)：342.11 张旭，王锦玉，仝燕，等. 大孔树脂技术在中药提取纯化中的应用及展望J. 中国实验方剂学杂志，2012，18(6)：286.