酵母菌株ZZ-46利用木质纤维素水解液产油脂的研究.DOC

1、酵母菌株 ZZ-46 利用木质纤维素水解液产油脂的研究李 斌 刘旭敏 肖泽涛 韩 尧 王冬梅 郭书贤 *（河南省工业微生物资源与发酵技术重点实验室；南阳理工学院生物与化学工程学院，南阳 473004)摘 要 利用小麦秸秆和甘蔗渣制备木质纤维素水解液，确立了可行的脱毒方法，研究酵母菌株 Trichosporon dermatis ZZ-46 在脱毒水解液与未脱毒水解液中的发酵产油能力，并采用摇瓶发酵培养，对菌株发酵过程、产油能力、发酵动力学以及油脂脂肪酸组成进行了探索。结果表明：采用氢氧化钙与活性炭混合脱毒法最佳，此时糠醛毒性物质含量最低，仅为0.0322 g/mL，ZZ-46 利用该脱毒水解液

2、发酵产油较高，120 h 时为 ZZ-46 最佳培养时间，生物量、油脂产量、油脂含量分别为 18.502 g/L、6.793 g/L、36.71%。发酵动力学分析表明：ZZ-46 的底物消耗与菌体生长同步，属于与菌体生长相关型，而油脂积累则属于与菌体生长部分相关型。不饱和脂肪酸含量较高是该油的特点。这对发酵木质纤维素水解液产油脂的研究具有重要意义。关键词 木质纤维素 Trichosporon dermatis ZZ-46 产油脂能力 动力学参数分析中图分类号：TS222 文献标志码： A 文章编号：20180121Study on the Use of Lignocellulose Hydro

3、lysate Fermentation for Oil by Yeast ZZ-46 LI Bin LIU Xumin XIAO Zetao HAN Yao WANG Dongmei GUO Shuxian*(Henan Key Laboratory of Industrial Microbial Resources and Fermentation Technology; School of Biological and Chemical Engineering, Nanyang Institute of Technology, Nanyang 473004)Abstract This to

4、pic using wheat straw and bagasse hydrolyzed with raw material preparation, on the basis of the established the possible method of detoxification, studied Trichosporon dermatis ZZ-46 in hydrolysate hydrolyzed and detoxification of fermentation capacity. Using the shaking flask fermentation cultivati

5、on, the fermentation process, capacity and the fermentation kinetic parameters were analysied. The results showed that the calcium hydroxide mixed with acticarbon was the best detoxification method. The content of furfural was the lowest, only 0.0322 g/mL. Trichosporon dermatis ZZ-46 used detoxified

6、 lignocellulose hydrolysate to produce high oil production. The results showed that the 120 h as the best training time, and the coefficient of biomass, oil production, oil content were 18.502 g/L, 6.793 g/L and 36.71%. Fermentation kinetics analysis showed that Trichosporon dermatis ZZ-46 of the su

7、bstrate consumption growth synchronization with bacteria, belong to the type was related to the growth of the bacteria, and the oil accumulation type belonged to the part related to the growth of the bacteria. The character of oil is the high content of unsaturated fatty acid. The study of lignocell

8、ulose hydrolysis fermentation to produce oil is of great significance.Key words Lignocellulosic, Trichosporon dermatis ZZ-46, Oil production capacity, Fermentation kinetic analysis 1基金项目：河南省基础与前沿技术研究计划项目(102300410059) ；河南省高等学校重点科研项目计划(16A550016)收稿日期：2018-02-05第一作者简介：李斌，女，1984 年出生，讲师，食品生物技术。*通讯作者简介：郭

9、书贤，男，1963 年出生，教授，微生物油脂。微生物油脂是除了植物油脂和动物油脂之外的又一油脂资源 1，是由真菌、细菌或微藻等产油微生物利用糖类、烃类和一般油脂作为碳源，并配合氮源和无机盐辅助因子在特定情况下产生的物质。从德国科学家首次发现产油微生物以来，科学家们从未停止研究。20 世纪 80 年代，新西兰、日本、英国、法国等对一些高产 -亚麻酸、花生四烯酸的微生物进行了大规模生产，并将一些发酵产品投入市场。90 年代后，研究的重点都在如何获取功能性油脂上。随后，科学家们发现大部分微生物生产的油脂在脂肪酸组成上与植物油脂类似，以 C16、C 18 脂肪酸为主，均富含饱和、低度不饱和长链脂肪酸，

10、这使得微生物油脂有潜力成为生物柴油的生产原料 2。利用木质纤维素生产油脂不仅可以获得作为新油源的微生物油脂，而且有助于解决农业废弃物问题。木质纤维素含有纤维素、半纤维素和木质素，另外还有少量的灰分、蛋白质、淀粉等成分组成 3-4。木质纤维素里能水解成被利用的糖是纤维素和半纤维素，而木质素的结构会降低对纤维素和半纤维素的利用，因此木质纤维素材料要进行预处理才能打破木质素的结构，提高对木质纤维素的利用率 5-9。纤维素水解是将预处理获得的纤维素经水解转化为单糖，才能够被产油酵母利用。木质纤维素水解较难，影响其水解的因素主要有结晶度、木质素对纤维素的保护作用、物料特性及半纤维素对纤维素的包裹 10-

11、14。以木质纤维素为原料，经粉碎后稀酸水解得到发酵液，并进一步脱毒处理可用于油脂酵母的利用 15-17。因此，对水解技术和脱毒技术要有进一步的研究。能源短缺和环境污染是人类当今面临的两大难题，因传统能源消耗大、污染严重、发展新型清洁的可再生能源已成为全球关注的热点 18。从土壤中分离筛选出的 Trichosporon dermatis ZZ-46 可同步利用葡萄糖和木糖生产油脂，通过本次研究也将真正探索出酵母菌利用木质纤维素产油脂发酵的规律所在，以便提高生产效率。同时，产油微生物也将为人类打开另一扇能源窗户，缓解人类的能源问题。1 材料与方法1.1 材料与试剂1.1.1 实验菌株Trichos

12、poron cutaneum CGMCC2.571 购于中国工业微生物菌种保藏管理中心， Trichosporon dermatis ZZ-46 河南省工业微生物资源与发酵技术重点实验室保藏。1.1.2 培养基YEPD 培养基：葡萄糖 20 g，酵母粉 10 g，蛋白胨 10 g，水 1000 mL，pH 自然，121 饱和蒸汽灭菌 20 min。基础发酵培养基：葡萄糖 70 g，酵母粉 0.75 g，NH 4Cl 0.1 g，KH 2PO4 11.8 g，K 2HPO4 3.7 g，CaCl 2H2O 40 mg，MgCl 2 1.0 g，CaCl 2 40 mg，FeSO47H 2O 5.

13、5 mg，ZnSO 47H2O 1.0 mg，Na 2SO4 0.1 g，MnSO 44H2O 0.76 mg，浓 H2SO4 0.00184 mg，柠檬酸 5.2 mg，水 1000 mL，pH 5.86.0，在 121 饱和蒸汽灭菌 20 min。发酵培养基：木质纤维素稀酸水解液脱毒后，在 121 饱和蒸汽压下灭菌 20 min。在基础发酵培养基中用水解液代替 1000 mL 水及总糖（其余同基础发酵培养基）作为发酵培养基。1.1.3 实验试剂酵母粉（BR） 、蛋白胨（ BR） 、葡萄糖（ AR） 、柠檬酸（AR） 、NH 4Cl （AR） 、KH 2PO4 （AR ） 、浓盐酸（AR）

14、、浓硫酸（AR） 、纤维素酶（酶活力 15000.0 U/g） 、木聚糖酶（酶活力 15000.0 U/g）等 国药集团化学试剂有限公司。1.2 仪器与设备SW-CJ-2G 超净工作台：苏州净化设备有限公司； HZQ-B 大型恒温摇床：苏州威尔实验用品有限公司；DNP-9082 电热恒温培养箱：上海精宏实验设备有限公司；TDL-40B 离心机：上海安亭科学仪器厂；752N 紫外-可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司。1.3 方法1.3.1 水解液的制备将小麦秸秆和甘蔗渣按 11 的质量比称取样品 25 g，置于三角瓶中，加入 1%的稀硫酸（固液比16） ，121 下水解 60 min。取出

15、水解后的样品，加入蒸馏水（固液比 14） ，待样品冷却到常温后，用 NaOH 调节 pH 值为 5.0。再加入 MgCl2 0.1375 g，吐温 0.375 mL，纤维素酶 2.00 g/100 g，木聚糖酶2.00 g/100 g。密封，置于 45 下水浴振荡 48 h 后，离心，抽滤。1.3.2 脱毒方法Ca(OH)2 法：将水解液放入烧杯中，60 水浴保温，用 Ca(OH)2 粉末调节 pH 至 1011，抽滤，得滤液，H 3PO4 调节 pH 到 6.0，抽滤，得滤液 19。活性炭吸附法：按固液比 15 向水解液中加入活性炭，28 摇床中（120 r/min）下振荡 60 min，过

16、滤活性炭后得滤液 20。混合脱毒法：将以上两种脱毒方法混合使用，进行脱毒处理。1.3.3 培养方法1.3.3.1 菌种活化Trichosporon cutaneum CGMCC2.571、Trichosporon dermatis ZZ-46 划线接种至 YEPD 固体斜面培养基，28 培养 48 h。1.3.3.2 摇瓶种子液的培养活化后的菌体接两环于 YEPD 液体种子培养基中，28 ，120 r/min 培养 36 h。1.3.3.3 摇瓶发酵培养取培养 36 h 的种子液，按 10%接种量接种于发酵培养基中， 28 ，200 r/min 培养 5 d，每间隔 12 h 测定生物量、油脂

17、产量、残糖 19。1.3.4 测定方法1.3.4.1 OD 值（采用光电比浊法） 取适量培养液，将样液稀释至 OD 值在 0.20.8 范围，用分光光度计在 660 nm 下测定光密度值 21。1.3.4.2 总糖的测定（苯酚-硫酸法）精密称取烘干至恒重的葡萄糖标准品 0.0500 g，以蒸馏水定容至 500 mL，配制成 100 g/mL 葡萄糖标准溶液。精确量取 100 g/mL 葡萄糖标准溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL 于 8 支10 mL 比色管中，各加蒸馏水补至 2.0 mL，依次加入 6%苯酚 1 mL，浓硫酸 5 mL，摇匀，70 水浴中加

18、热 20 min 后冷却至室温，测定 490 nm 吸光度。以糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线 22。样品液稀释一定浓度后，取 2 mL，按上述步骤操作，根据标准曲线计算总糖含量。1.3.4.3 残糖测定（DNS 法）精密称取烘干至恒重的葡萄糖标准品 100 mg，以蒸馏水定容至 100 mL，配制成 1 mg/mL 葡萄糖标准溶液。精确量取 1 mg/mL 葡萄糖标准溶液 0、0.2、0.4、0.6 、0.8、1.0、1.2 mL 于 7 支 25 mL 具塞试管中，各加蒸馏水补至 2.0 mL，分别加入 DNS 试剂 2.0 mL，摇匀，沸水浴 5 min 显色，冰水冷却至室温

19、，分别加入 9.0 mL 蒸馏水，摇匀，测定 540 nm 处吸光度值(A) 。以第一支试管作为空白对照，以葡萄糖含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线 22。1.3.4.4 发酵液中糠醛含量的测定精确称取糠醛，用蒸馏水配制 0、0.5、1.0、1.5、2.5、3.0、4.0 g/mL 标准溶液，测定 276 nm 吸光度。以糠醛浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线 23。1.3.4.5 油脂的提取及含量测算（磷酸香草醛法）摇瓶培养皮状丝孢酵母 Trichosporon cutaneum CGMCC2.571 发酵液，使用酸热法提取油脂，收集得到氯仿层，旋转蒸发，得液体石蜡。取 5

20、 个 100 mL 容量瓶，精确吸取不同剂量皮状丝孢酵母液体油脂 0.02、0.016、0.012、0.01、0.008 g，配置浓度为 0.2、0.16、0.12、0.1、0.08 g/L 的油脂样品（溶剂为 12 的乙醇正己烷） 。取 6 根试管，其中 5 支试管加入配好的皮状丝孢酵母油脂样品各 1 mL，1支加入蒸馏水，作为空白对照。把这 6 支试管放入沸水浴中，蒸干后加入 2 mL98%硫酸，混匀，置于90 水浴加热 20 min，取出后在冰水浴中冷却至室温。加入 0.25 g/L 香草醛磷酸溶液 3 mL，摇匀，室温反应 20 min，在 530 nm 处测定吸光度。以油脂含量为横坐

21、标，吸光度为纵坐标作图 24。1.3.4.6 菌体生物量测定（细胞干重法）量取一定体积的待测发酵液 V（mL）于已称重的 7 mL 的离心管（m 1，g）中，8000 r/min 离心 5 min。下层沉淀用蒸馏水洗涤 3 次后，8000 r/min 离心 5 min，弃上清，下层沉淀放入鼓风干燥箱中 105 烘干至恒重，干燥器中自然冷却至室温后称总重量（m 2，g） 。菌体生物量以细胞干重（m，g/L ）表示，计算公式 19如下：m =（m 2m 1）1000/V1.3.4.7 发酵动力学研究 为了研究产油脂酵母的生长、底物消耗以及产物生成的动力学特征，每隔 12 h 取样测定残糖量（S，g

22、/L） 、菌体生物量（X，g/L ）及油脂产量（P ，g/L） ，计算菌体的比生长速率 （h -1） 、底物比消耗速率 Qs（h -1）和油脂比生成速率 Qp（h -1） ，得到 、Q s、Q p 随发酵时间 t（h）的变化规律，根据菌体生物量、油脂产量及残糖量的增减，计算其动力学参数，进行发酵动力学分析 19。 = 21ln-tQs= 12()/-SQp= 1()PXt1.3.4.8 油脂脂肪酸组成及相对含量的分析样品甲酯化 25：取样品油 0.1 g，加入 0.5 mol/L KOH-甲醇溶液 2 mL ，于 65 水浴中皂化 30 min，加入 BF3-乙醚溶液（1:1） 0.2 mL，

23、再在 65 水浴中甲酯化 5 min，取出，迅速冷水冷却，加入石油醚 2 mL，振荡，静置 20 min，吸取上清液 0.30.5 L 作为气相色谱的进样样品。 气相色谱检测条件：色谱柱是 FFAP 石英毛细管柱（30 m0.32 mm0.4 m） ，柱温 190 ，气化温度 230 ，检测器（FID）温度 230 ，载气（N 2）流速 41 mL/min，燃气（H 2）流速 33 mL/min，助燃气（空气）流速 100 mL/min，分流比：201，进样量为 1 L。不饱和脂肪酸指数（IUFA）=1单烯酸含量%+2二烯酸含量%+3三烯酸含量%+nn 烯酸含量%。定性方法：将测得的样品色谱图

24、各峰的保留时间与脂肪酸标准品的保留时间作比较，确定样品色谱图各峰的性质。 定量方法：面积归一法。由于相同质量脂肪酸甲酯各组分在 FID 检测器上的响应值接近，不引入定量校正因子，各组分含量按下式计算：P（%）=Ai/ Ai100%式中：P（% ） 表示组分的相对含量， Ai 表示组分的峰面积， Ai表示各组分的峰面积总和。 1 结果与分析2.1 不同脱毒方法下糠醛含量的检测根据糠醛标准曲线 y=0.1868x+0.0064（R 2=0.9997）计算得不同脱毒方法下糠醛的含量见表 1。由表 1 可知，混合脱毒法脱毒效果较好，糠醛含量最低。因此，优先采用氢氧化钙与活性炭混合脱毒法进行纤维素水解液

25、原液的脱毒处理，以防有毒物质对产油酵母的生长产生抑制作用。表 1 不同脱毒方法下糠醛含量的检测脱毒处理方法 糠醛含量（g/mL ）纤维素水解液原液 1.5650.043氢氧化钙脱毒 0.3970.023活性炭脱毒 0.1350.003氢氧化钙+活性炭脱毒 0.03220.0012.2 ZZ-46 在脱毒与未脱毒水解液中产油脂能力的比较将 Trichosporon dermatis ZZ-46 接种在脱毒水解液的发酵培养基与未脱毒水解液的发酵培养基中，发酵 120 h 后，计算其油脂产量，比较 Trichosporon dermatis ZZ-46 在脱毒与未脱毒水解液中发酵产油脂的能力。结果如

26、下表 2：表 2 ZZ-46 利用不同水解液发酵产油能力名称 脱毒水解液 未脱毒水解液菌体生物量（g/L） 18.5020.002 13.7510.005油脂产量（g/L） 6.7930.006 4.7080.006油脂含量（%） 36.71 34.24根据皮状丝孢酵母油脂的磷酸香草醛显色法标准曲线公式 y=3.3257x-0.0954（R 2=0.9992）进行计算，结果显示产油酵母在脱毒水解液中长势较好，且生物量达到 18.502 g/L，油脂含量达到 36.71%，而未脱毒水解液中菌体生物量是 13.751 g/L，油脂含量为 34.24%。所以，Trichosporon dermati

27、s ZZ-46菌株在脱毒水解液中产油能力要高于未脱毒水解液。图 1 ZZ-46 在不同水解液发酵 120h 的光学显微镜照片注：A.脱毒水解液； B.未脱毒水解液由图 1 可以看出，Trichosporon dermatis ZZ-46 菌株培养 120 h 后，在脱毒水解液中菌体生物量和产油能力明显高于未脱毒水解液。2.3 ZZ-46 利用水解液发酵过程的研究利用混合脱毒的水解液，添加适合 Trichosporon dermatis ZZ-46 生长所需的微量元素营养物质，在25 ，120 r/min 的条件下进行摇床发酵培养，每隔 12 h 取样一次，测定其生物量、油脂产量和残糖量。表 3

28、 ZZ-46 利用脱毒水解液发酵产油情况时间（h） 生物量（g/L） 油脂产量（g/L） 油脂含量（%） 残糖量（g/L）0 0 0 0 40.0020.02412 3.0620.012 0.2840.001 9.27 38.6730.064A B24 3.6230.012 0.4240.002 11.70 38.0240.08236 4.4210.022 0.5540.002 12.53 37.9790.06248 6.4790.022 0.8830.003 13.63 34.5300.00860 9.4510.022 1.4640.001 15.49 24.6610.07272 12.46

29、20.012 2.0490.002 16.44 16.2850.06284 15.3830.032 3.0140.002 19.59 9.4940.00796 17.0820.006 4.0230.004 23.55 8.0770.051108 17.8790.014 5.5450.006 31.01 2.1640.002120 18.5020.002 6.7930.006 36.71 1.2330.003132 19.3240.007 7.1480.002 36.99 1.0540.002144 19.6230.009 7.3170.002 37.29 0.9340.002由表 3 可知，随

30、着时间的增加，菌体生物量、油脂产量逐渐增大，残糖量逐渐减少。油脂含量在120 h 后上升平缓，在 144 h 达到最高峰 37.29%。菌体生物量前 36 h 变化都比较缓慢，在 3696 h 才有明显升高，菌体生长旺盛，处于对数生长期。96 h 后，由于对数生长期细胞的大量繁殖，培养基中营养物质消耗，有害物质逐渐积累，菌体生物量增长变缓，菌体生长趋于稳定。120 h 后，由于发酵液的粘度增大使通氧受限、营养物质的缺乏以及有毒抑制物的存在等不利因素的影响，使其发酵过程减慢，菌体开始进入减速期。可见，最佳培养时间为 120 h。12h 48h60h 84h图 2 ZZ-46 在不同时期的光学显微

31、镜照片由图 2 可知，Trichosporon dermatis ZZ-46 菌株在培养初期，细胞呈圆杆状，随着培养时间的延长，细胞形状逐渐变成椭圆形，细胞内逐渐产生 14 个脂肪球，有的多于 4 个，脂肪球较大，占细胞体积比例也较大。培养 120 h 后，菌体生物量、油脂产量无明显区别，菌体生长趋于稳定。因此，最佳培养时间为 120 h。2.4 ZZ-46 发酵动力学参数分析 为了探讨 ZZ-46 的生长、底物消耗、产物生成特征，在 25 ，120 r/min 的条件下利用混合脱毒的水解液进行发酵培养，每隔 12 h 取样测定菌体生物量 X、残糖量 S 及油脂产量 P，计算菌体利用水解液中还

32、原糖的比生长速率 、底物比消耗速率 Qs 和油脂比生成速率 Qp，得到 、Q s 和 Qp 随发酵时间的变化规律，结果如图 3 所示。 由图 3 可知：在培养前 12 h，菌体比生长速率 和总底物比消耗速率 Qs 迅速增长，在 1224 h期间达到最大值。同时，油脂比生成速率 Qp 增长不大。这说明此时菌体大量繁殖消耗营养物质，而几乎不积累油脂。此后，菌体比生长速率 和总底物比消耗速率 Qs 则迅速降低，油脂比生成速率快速增长，在 7284 h 期间达到最高，84 h 之后比较稳定，说明此时细胞内开始积累油脂。随着时间延长，120 h 后菌体生长进入减速期，生长产油能力逐渐减退。108h 12

33、0h132h 144h图 3 ZZ-46 发酵产油脂的 、Q s、Q p 变化曲线2.5 ZZ-46 在脱毒水解液中产油脂的脂肪酸组成分析图 4 脂肪酸标准品的气相色谱图谱表 4 zz-46 在脱毒水解液发酵培养基中产油脂肪酸组成分析由表 4 分析可知：ZZ-46 菌株利用木质纤维素脱毒水解液产生的菌油以油酸为主，其次为棕榈酸、亚油酸，三种脂肪酸约占总脂肪酸的 81.58%。其中，油酸含量占 36.2%、棕榈酸含量占 22.77%、亚油酸含量占 22.61%。ZZ-46 不饱和脂肪酸指数（ IUFA）也比较高，大于 85%，还能形成一部分多不饱和脂肪酸，这些脂肪酸具有一定的保健功能和对某些疾病

34、有一定的治疗效果等 26。2 结论（1）通过对不同脱毒方法下水解液中糠醛含量的测定，确定了氢氧化钙+活性炭混合脱毒法为最佳方法。其中，原水解液糠醛含量为 1.565 g/mL ，氢氧化钙、活性炭、混合脱毒法脱毒后糠醛含量分别为：0.397 、0.135 、0.0322 g/mL 。混合脱毒法糠醛含量最低，优先选用混合脱毒法进行脱毒处理。（2）在研究 ZZ-46 利用木质纤维素水解的发酵产油脂能力时，随着时间的延长，菌体生物量、油脂产量逐渐增大，油脂含量在 120 h 左右趋于稳定。同时，残糖量逐渐减少，直至达到0.934 g/L。菌体生物量前 36 h 变化都比较缓慢，在 3696 h 才有明

35、显升高，菌体生长旺盛，处于对数生长期。96 h 后，由于对数生长期细胞的大量繁殖，培养基中营养物质消耗，有害物质逐渐积累，菌体生物量增长变缓，菌体生长趋于稳定。120 h 后，由于发酵液的粘度增大使通氧受限、营养物质的缺乏以及有毒抑制物的存在等不利因素的影响，使其发酵过程减慢，菌体开始进入减速期。可见，最佳培养时间为 120 h。（3）由发酵生长动力参数可得：菌株的底物消耗与菌体生长同步，属于与菌体生长相关型，而油脂积累则属于与菌体生长部分相关型。（4）ZZ-46 菌株利用木质纤维素脱毒水解液产生的菌油不饱和脂肪酸含量较高。参考文献： 1 郭书贤, 罗建成, 王冬梅,等. 利用啤酒生产废水培养

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37、14:0 棕榈酸 C16：0 棕榈油酸 C16:1 硬脂酸 C18:0 油酸 C18:1 亚油酸 C18:2 亚麻酸 C18:3 未知 IUFA%ZZ-46 0.06 0.87 22.77 1.46 12.64 36.20 22.61 1.16 2.23 86.362 柳杰 , 刘文慧, 王晚晴 , 等. 产油微生物及其发酵原料的研究进展J. 环境工程, 2017, 35(3): 132-136LIU Jie, LIU Wenhui, WANG Wanqing, et al. Research advances in oleaginous microorganisms and fermenti

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