蛋白质分子基础复习整理笔记.doc

1、整理：许智润 2011 年末考试覆盖率 100% 1 蛋白质分子基础 题型： 名词解释 5-6 个 简答题 4 个 问答和计算 3 个 问答肯定有一题是实验设计 有一题是蛋白质一级结构的测定 附加题 目录 第一章 绪论 氨基酸 . 1 第二章 蛋白质制备 . 4 第三章 蛋白质一级结构测定 . 10 第四章 蛋白质的化学修 . 15 第五章 肽的人工合成 . 17 第 六章 蛋白质的分子构象 . 17 第七章 蛋白质的结构与功能关系 . 19 每章需掌握的知识 （ P.S 结合了老师最后一节课的内容，但最好不要只按照这个来复习，有空一定要看 PPT 看书；否则挂了可不要怪我哦！） 第一章 绪论

2、 氨基酸 常见 20 种氨基酸及其疏水性、亲水性、带电性、代号、旋光性、等电点 疏水性、亲水性： 亲水性 (极性 R 基 ) 不带电荷 丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺 带电荷 (强亲水性 ) (碱性 )带正电 赖氨酸、精氨酸、组氨酸 (酸性 )带负电 天冬氨酸、谷氨酸 （怀疑 PPT 的天冬酰胺、谷氨酰胺上打错） 疏水性（非极性 R 基） 丙氨酸 (R 基的疏水性最小）、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸 甘氨酸： R 基为 -H，可算作疏水性氨基酸，又可以划到亲水性氨基酸。甘氨酸的 a-碳不是手性碳，故没有旋光性。 不带电荷的极性 R 基氨基酸

3、：带有 -OH(Ser、 Thr、 Tyr )、 -SH(Cys)、酰胺基 (Asn、 Gln) 整理：许智润 2011 年末考试覆盖率 100% 2 代号： 甘氨酸 Gly 脯氨酸 Pro 苏氨酸 Thr 天冬氨酸 Asp 丙氨酸 Ala 苯丙氨酸 Phe 半胱氨酸 Cys 谷氨酸 Glu 缬氨酸 Val 酪氨酸 Tyr 甲硫氨酸 Met 赖氨酸 Lys 亮氨酸 Leu 色氨酸 Trp 天冬酰胺 Asn 精氨酸 Arg 异亮氨酸 Ile 丝氨酸 Ser 谷氨酰胺 Gln 组氨酸 His 名词解释： 必需氨基酸： 8 种，体内不能合成，必须由食物中的蛋 白质供给。 非必需氨基酸： 12 种，只

4、要有氮元素存在人体就能自己制造，组成人体蛋白质的重要成份，而且保持一定比例。 半必需氨基酸：人体合成速度慢 ,不能满足人体需求。 氨基酸的等电点： 氨基酸分子中所含的 NH3+ 和 COO 数目 正好相等 ，净电荷为 0 时的环境 pH值即为氨基酸的 等电点 ，简称 pI。 氨基酸等电点的计算： 侧链不带电荷中性氨基酸，其等电点是它的 pK1和 pK2的算术平均值： pI = (pK1+ pK2 )/2 酸性氨基酸：（这个是对于含有 3 个可解离基团的氨基酸来 说的，可以看下面的方法） pI = (pK1 + pKR COO- )/2 碱性氨基酸：（这个是对于含有 3 个可解离基团的氨基酸来说

5、的，可以看下面的方法） pI = (pK2 + pKR NH2 )/2 对于含有 3 个可解离基团的氨基酸 来说，只要依次写出它从酸性经过中性至碱性溶溶解高过程中的各种离子形式，然后取两性离子两侧的 pK值的算术平均值，即可得其 pI 值。 步骤： 由 PK值判断解离顺序，总是 PK1 按照解离顺序正确写出解离方程式：简式，注意解离基团的正确写法。 找出呈电中性的物质，其左右 PK值的平均值就是氨基酸的等电点： PI（ PK 左+PK右） /2 整理：许智润 2011 年末考试覆盖率 100% 3 举例： 1.半胱氨酸 pK1( -COO-)=1.96， pK2(R-SH)=8.18， pK3

6、( -NH3+)=10.28，该氨基酸 pI 值为： A.5.07 B.6.12 C.6.80 D.7.68 E.9.23 2.赖氨酸 pK1( -COO-)=2.18， pK2( -NH3+)=8.95， pK3(R-NH3+)=10.53，该氨基酸 pI 值为： A. (pK1+ pK2)/2 B. (pK2+ pK3)/2 C. (pK1+ pK3)/2 D. (pK1+ pK2+ pK3)/3 E. (pK1+ pK2+ pK3)/2 3 .天冬氨酸 pK1( -COO-)=1.96， pK2( -COO-)=3.65， pK3( -NH3+)=9.60，该氨基酸 pI值为： A.2.

7、8 B.3.65 C.5.74 D.6.62 E.7.51 旋光性： 从蛋白质 温和水解得到的 a-氨基酸都是 L 型的。 D-丙氨酸存在于昆虫的幼虫和蛹中。 D-亮氨酸存在于短杆菌肽中。 在细菌中发现了许多 D-型的非蛋白质氨基酸 D-谷氨酸和 D-丙氨酸存在与细菌细胞壁的肽聚糖中。 甘氨酸的 a-碳不是手性碳，故没有旋光性。 光吸收： 220-300nm： Tyr、 Phe、 Trp 苯丙 Phe 的 257nm 酪 Tyr 的 275nm 色 Trp 的 280nm 蛋白质的生物学 /行使的功能： 新陈代谢的催化剂 -酶 。 有机体的 结构 成分。 储藏氨基酸 的功能。 运输 功能。 激

8、素 的功能。 免疫 的功能。 接受和传递 信息 作用功能。 调节 或者 控制 功能。 整理：许智润 2011 年末考试覆盖率 100% 4 第二章 蛋白质制备 蛋白质分离纯化的一般程序及其注意事项 1.生物组织的机械破碎 :研磨法、超声波法、冻融法和酶解法等 (细胞外分泌物无需破碎 )。 2.根据 蛋白质 的特性，选择不同的溶剂进行 抽提 。 水溶性蛋白用中性缓冲溶液抽提， 酸性蛋白用稀碱性溶液抽提， 脂溶性蛋白用表面活性剂抽提等。 3.离心 :去亚细胞颗粒、细胞碎片等 4.粗提 : 离心除去固体杂质后，可通过沉淀法、超滤法、萃取法等处理，得到蛋白质粗制品。 5.精制 ：可用 层析法、电泳法等

9、进行精制。 6.结晶 ：取得蛋白质晶体并测定蛋白质的性质。 注意事项： 动物组织 和 器官 要尽可能 除去结缔组织 和 脂肪 。 制备 植物细胞 时，在缓冲液中 加入聚乙烯吡咯啉酮 (PVP)可以 减少褐变 , 它可以吸附多酚化合物。 革兰氏阳性菌 可用 溶菌酶消化 ， 37oC 处理 15 分钟即可溶解细胞壁。 革兰氏阴性菌 较难消化。可先 用非离子去污剂 （如 Triton X-100）、 巯基乙醇或甘油处理细胞 。在溶液中还可加入 脱氧核糖核酸酶 I（ 10 ug/mL），可以使溶液的黏度降低，可以 提高抽提液的质量 。 膜蛋白的释放： 外周 蛋白 通过 静电力或共价键 和外膜脂质的极性

10、头部螯合在一起。 占膜蛋白的 2030% 内在蛋白（固有蛋白） 嵌合 在膜脂双层结构中。 大部分膜蛋白是固有蛋白 外周蛋白的分离： 改变离子强度； 金属螯合剂（ EDTA）可将其抽提出来 内在蛋白的提取： 提取的原则 抽提膜蛋白时，首先 削弱膜蛋白和膜脂的疏水结合 ，同时 保持疏水基暴露在外 的天然状态。此过程叫做 增溶 作用。 常用的增溶剂是去污剂 ，它可以使膜蛋白疏水部分与膜分离，同时保留住膜蛋白表面的疏水结构。 用去污剂增溶之后，膜蛋白要 用透析的方 法除掉去污剂 ，再进行其他方法的分离纯化。 整理：许智润 2011 年末考试覆盖率 100% 5 盐析的概念 是一种向蛋白质溶液中加入浓的

11、盐溶液使蛋白质变性的方法。 盐溶 ：一般在 低盐浓度下 随着 盐浓度升高 ，蛋白质的 溶解度增加 。 盐析 ：当 盐浓度继续升高 时，蛋白质的 溶解度 不同程度 下降 并先后 析出 。原因 :将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的 SO4 和 NH4)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出 ,导致蛋白质分子的沉淀。 课件重点补充： 膜蛋白破碎的主要方法：膜蛋白的释放，上面有。 蛋白质脱盐： 透析法（注 ：用前在含 EDTA的溶液中煮 -除去核酸酶和蛋白酶）； 纤维过滤透析法； 中空纤维超滤膜 分子筛层析法； Sephadex G-25

12、 蛋白质浓缩： 沉淀法：用盐析法或者有机溶剂法将蛋白质沉淀，再将沉淀溶于少量溶液中； 吸附到离子交换柱上，然后用少量盐洗脱； 干燥吸附法：用固体吸附剂如 Sephadex G25 等，冻干法，真空干燥法； 渗透浓缩法：将干粉 PEG-20000 涂在装有蛋白质溶液的透析袋上，可吸干水分； 超滤浓缩法：用超滤膜滤去小分子和水，达到超滤的目的。 使 蛋白质沉淀的主要方法及其原理 (重点 :盐析方法 ) 盐析法（上面有）； 有机溶剂法：原理： 1.增大带电质点之间的静电力。 2.破坏蛋白质表面的水合层，使蛋白质分子脱水而沉淀。 有 机聚合物沉淀法；（作用原理与有机溶剂类似） 选择性变性沉淀法： 适用

13、于提取一些耐极端环境的蛋白质。用一些极端条件，使非目标蛋白质变性析出，从而将目的蛋白质纯化。主要方法有：热变性； pH变性 (包括等电电变性 )；有机溶剂变性。 非特异性层析的原理、方法（如何平衡、如何吸附、如何洗脱 .） 吸附层析、离子交换层析、凝胶过滤层析 离子交换层析 原理 :根据蛋白质分子 所带 电荷的不同 来达到分离的目的 . 解离离子带负电，结合 阳离子 （蛋白质分子），称为 阳离子 交换柱。 解离离子带正电，结合 阴离子 （蛋白质分子），称为 阴离子 交换柱。 步骤： （处理介质 -装柱 -上样 -洗涤 -洗脱 -介质再生） 方法： 平衡：电荷量越大 ,结合越牢 ,在柱中移动速度

14、越慢 ;电荷不同 ,亲和力不同 . 洗脱：带电蛋白质分子与交换剂的结合可逆。通常 ,用 盐梯度 和 pH 梯度 可把吸附的蛋白质从柱上洗脱下来 . 整理：许智润 2011 年末考试覆盖率 100% 6 其他：离子交换的支持物 纤维素：具有松散的亲水性网络 ,较大的的表面积、 吸附容量大 ， 通透性好 。 葡聚糖凝胶：既有 离子交换剂的 性质 ，又有 分子筛效应 。 琼脂糖凝胶： 吸附容量大 ，能维持较好的 流速 和 分辨率 。 习题 1： 三个氨基酸（ Leu,Asp,Lys）的混合物，经过一个阳离子交换树脂粒，用 pH5 的缓冲液洗脱，洗脱液中氨基酸出现的顺序是 A Asp,Leu,Lys;

15、 B Leu,Asp,Lys; C Lys,Leu,Asp; D Leu,Lys,Asp 解： Leu 0,Asp -,Lys + Asp Leu Lys 自己做的，不知道对不对 习题 2： 有以下 4 种蛋白质的混合物：（ 1） pI=10；（ 2） pI=4；（ 3） pI=8.6；（ 4） pI=5. 若不考虑其它因素，当它们流过 DEAE-纤维素阴离子交换柱，用线性盐梯度洗脱时 ,这些蛋白质的洗脱顺序如何，并具体说明其原因。 答案 :在离子交换柱上，带更多负电的吸附能力更强。四种蛋白质 PI 值的顺序为 1342。因此，在某种 pH值下，所带电荷由正到负的顺序为 1342。因此，洗脱出

16、现的先后顺序就是 1342。 凝胶过滤层析 原理： 根据 分子量的大小 不同而达到分离的目的。载体是一种多孔的凝胶。分子直径比凝胶孔径大的分子 ,不能进入凝胶颗粒的微孔中 ,其他分子由大到小先后从凝胶中流出。 疏水层析 (吸附层析 ) 原理： 根据蛋白质分子 疏水性 的不同而达到蛋白质分离的目的。在不带电的载体上偶联上疏水基团形成疏水吸附剂，将带有非极性的 生物活性物质 吸附在一起，然后改变层析条件，减弱疏水作用，将吸附物质解离下来。 洗脱： 改用低浓度的盐 ;降低离子强度 ;加乙二醇。在洗脱也中加去污剂；增加洗脱 pH。 从高到低的 NaCl 浓度梯度洗脱；或由高到低的盐浓度加由低到高的乙二

17、醇浓度梯度洗脱。 注意： 离子交换：低盐吸附，高盐洗脱 疏水层析：高盐吸附，低盐洗脱 亲和层析的原理、步骤、作用力、专一性洗脱 、非专一性洗脱 原理： 根据特定蛋白质对某种的 生物专一性 来进行分离。 作用力： 专一性亲和力，在一定条件下紧密地形成复合物。 步骤：？ 洗脱： 非专一性洗脱 改变 缓冲液的 离子强度 或者 pH 或者 介电系数 。 使 吸附的大分子的 构象 发生 改变 ，以降低 其与配体之间的 亲和力 ，将吸附的大分子从层析柱上洗脱下来。 专一性洗脱 选用与配体 结合能力更大物质 的洗脱液。 eg.底物配体：底物类似物、酶抑制剂等 几种特殊的亲和层析： 免疫亲和层析： 根据生物大

18、分子的 抗原决定部位 与其 抗体的结合部位 之间 专一性 相互作用进 行层析的技术。 整理：许智润 2011 年末考试覆盖率 100% 7 共价亲和层析： 层析材料进与样品中的一个 成分 发生 专一性共价反应 ，使其保留在层析材料上。分离过程是依靠 共价键的形成和断裂 来实现的。 固定化金属离子亲和层析： 利用固定相载体上偶联的亚胺基乙二酸为配基与二价金属离子发生螯合作用，结合在固定相上，二价金属离子可以与流动相中含有的半胱氨酸、组氨酸、咪唑及其类似物发生特异螯合作用而进行分离的方法，称之为 金属螯合层析 。 实验设计（如何用亲和层析分离纯化蛋白酶） 1、前处理： 去脂肪、结缔 加酸化水捣碎

19、匀浆，提取 过滤，滤液调 pH 过滤，滤液调 pH，激活 调至 pH，过滤，保存 2、配体： 粗提 鸡卵类粘蛋白 离子交换层析精分离 透析除盐 析出，干燥 3、亲和层析： 抑制剂（鸡卵类粘蛋白）偶联至载体（凝胶） 装柱 上样 洗脱 附参考资料： 亲和层析法纯化胰蛋白酶 操作步骤 (一 ) 载体 SePharose4B 的活化 1环氧氯丙烷活化法： 取适量的 sepharose 4B，于 G 3 玻璃烧结漏斗 (简称 G 3 漏斗 )上抽去保护液。称 10g(湿重 )Sepharose 4B，用 100mL0.5mol/L 氯化钠溶液淋洗，除去 56Pha rose 4S 凝胶内的保护剂，用蒸馏

20、水洗净，转移到 100mL 的锥形瓶内。然后加入 6.5mL 2.0moL L 氢氧比钠溶液、1.5mL 环氧氯丙烷、 15mL 56 1， 4 二氧六环，于 45的恒温水浴摇床内振荡活化 2 小时。然后将活化的凝胶转移到 G3 漏斗内抽干，用蒸馏水洗至 pH8.0 左右，再用 20mL 0.1mol/L，pH9.5 碳酸钠缓冲液淋洗。处理完毕后立即偶联。 2溴化氰活化法： 称取 10g Sepharose 4B(湿重 )，凝胶处理方法与 1 相同，把 SePharose 4B 凝胶转移到一个100mL 的烧 杯中 (以下操作步骤必须在通风橱内进行 )。加入 15mL 0.2mol/LpH10

21、.0 的碳酸钠缓冲液，然后将烧杯放置冰浴中，用电磁搅拌器慢慢搅拌。戴上胶皮手套，小心称取 3g 溴化氰，加入 3mL 乙腈将溴化氰溶解。 取一支滴管向烧杯内滴加溴化氰使它与 Sepharose 4B 反应，同时取另一支滴管向烧杯内滴加 6mol/L 的氢氧化钠使反应体系的 pH 值保持在 pH10.0 左右 (在酸度计上校正 )，待溴化氰加完以后继续搅拌，反应 5 分钟。此时反应体系的 pH 值不再下降，仍维持在 pH10.0 左右，停止反应。迅速转移到 G3 漏斗内抽滤，抽滤瓶内应预先加入一定量的固体硫酸亚铁，以破坏滤液中未反应的溴化氰。用 200mL 预冷的蒸馏水淋洗，最后浸泡在 20mL

22、 整理：许智润 2011 年末考试覆盖率 100% 8 0.1mol/LpH9.5，碳酸钠缓冲液中，处理完成后立即偶联。 3配基 鸡卵类粘蛋白的偶联： 将已经活化处理好的 Sepharose 4B 转移到一个 50mL 的锥形瓶内。然后取 I0mL0.1mol/L，pH 9.5 的碳酸钠缓冲液将约 150mg 的鸡卵类粘蛋白溶解，取出 0.1mL 蛋白溶液稀释 30 倍，在紫外分光光度仪上测定 A280。根据消光系数 A 4.13 计算出偶联前的蛋白 含量。再将9.9mL 蛋白溶液加入到盛有活化 Sepharose 4B 的三角瓶内，混匀，在 40 45的恒温水浴摇床内振荡偶联 20 24 小

23、时左右，终止偶联。 将凝胶转移到 G3 漏斗内，用 100mL 0.5mol/L 的氯化钠溶液抽浊、淋洗，以除去未被偶联的鸡卵类粘蛋白。取一个干净的抽滤瓶收集滤波，测定滤液 A280，计算出末被偶联蛋白的量，然后用 100mL 的蒸馏水洗，用 50mL 0.1mol/L 甲酸 0.5mol/L 氯化钾， pH2.5 甲酸混合液洗，最后用蒸馏水洗至约 pH6.5 即可。将凝胶转移至 50mL 小烧杯 内，用 30mL 0.5mol/L氯化钾 0.05mol/L 氯化钙 0.1mol/L、 pH7.8Tris HCL 缓冲液浸泡 20 分钟。脱气后装柱或置 4冰箱保存。 (二 ) 胰蛋白酶粗操液的

24、制备 取 50g 猪新鲜 胰脏 (除去脂肪和结缔组织 )剪碎置于高速 组织捣碎 机内，加入 200mL 预冷的pH2.53.0 的乙酸酸化水， 匀浆 。于 10提取 4 小时以上， 4 层纱布 过滤，收集滤液 并用 5mol/L 的氢氧化钠 调至 PH8.0，加入终浓度为 0.1mol/L 氯化钙及 12mg 胰蛋白酶晶种，置 4 激活 1216 小时或在室温 (25左 右 )激活 24 小时 。待胰蛋白酪比活达到 10001500 BAEE 单位 mg 以后，用 6mol/L 硫酸 调至 pH3.0 停止激活 。 放置 4冰箱内备用。测定胰蛋白酶活性。 (三 )亲和层析纯化胰蛋白酶 取一支层

25、析柱 (10mm 100mm)，装入少量亲和柱平衡液 (0.5mol/L 氯化钾 0.05mol/L 氯化钙 0.1mol/L， pH7.8 Tris HCl 缓冲液 )，将亲和吸附剂一次装入柱内，待亲和吸附剂自然沉降至约 1/2 总体积后，调节合适的流速。用亲和柱平衡液平衡。用核酸蛋白质检测仪检测流出液待基线达到 稳定后即可。 取一定体积的蛋白酶粗提液 (30 50mL，视酶液的蛋白浓度及比活而定 )调至 pH8.0用滤纸过滤，取滤液上柱吸附，然后用亲和柱平衡液平衡。用核酸蛋白质检测仪检测流出液，待基线达到稳定后改用亲和柱洗脱液 (0.1mol/L 甲酸 0.5mol/L 氯化钾， pH2.

26、5 混合液 )洗脱。收集洗脱峰 2，测定酶蛋白含量及活性， 层析图谱，如图 3 9。 图 3 9 亲和层析纯化胰蛋白酶洗脱曲线 平衡液： 0.5mol/L 氯化钾， 0.05mol/L 氯化钙， 0.1mol/L， pH7.8Tris-HCl 缓冲液。 洗脱液： 0.1mol/L 甲酸， 0.5mol/L 氯化钾， pH2.5 混合液。 (四 ) 胰蛋白酶的保存 经亲和层析分离得到的胰蛋白酶，一般是比较纯的酶，但是酶蛋白的浓度往往很低。通常可整理：许智润 2011 年末考试覆盖率 100% 9 用 pH5.0 的乙酸透析除去溶液中的无机盐，然后冰冻干燥成粉末，长期保存。也可将酶溶液放在 20的

27、冰箱冰冻保存或者在 4， pH3.0 的酸性溶液中保存，可保存两年左右。 蛋白质电泳的牵引力（迁移率）与什么有关系 蛋白质分子的性质：分子的 电荷、大小和形状 。 电场：与 电流和电压 成正比。 缓冲液和离子强度： 缓冲液离子强度 增大，样品所 带电荷降低，样品的泳动速度会减缓。 支持 介质 ：纸的吸附作用最大，醋酸纤维素吸附作用较小。 为什么 SDS-PAGE电泳只与蛋白质的分子量有关系 在蛋白质中加入摩尔比为 1.4： 1(SDS:蛋白质 )的 SDS(十二烷基硫酸钠 )。 使所有蛋白质都带上负电 。 SDS 是阴离子去污剂，能与蛋白质的疏水部分结合，并且 把大部分蛋白质拆成组成他的亚基形

28、式 。 在上样缓冲液中加入 巯基乙醇 ，可以使二硫键还原为巯基。 使不同的蛋白质分子的短轴一致，长轴与蛋白质的分子量成正比 。 SDS-PAG 中，蛋白质电泳的速度不再取决于蛋白质的电荷与形状 ，只与蛋白质的分子量有关。 自己补充： PAGE 根据其有无浓缩效应，分为 连续系统和不连续系统两大类 ，连续系统电泳体系中缓冲液 pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。 不连续系统中由于 缓冲液离子成分， pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性 ，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。 注意：电泳结果显示的只是

29、亚单位的大小，同时蛋白质也会失去原来的活性。 有些蛋白质不能用 SDS-PAGE 测定分子量（某些糖蛋白以及一些结构蛋白， 如胶原蛋白） 3 种电泳（等电聚集电泳、双向电泳、免疫印迹法）的概念 等电聚集电泳 （精细，适用分析鉴定，抵消扩散使富集，不适用于等电点处沉淀变性蛋白） 书上：利用某些两性电解质支持物在电场中形成 pH梯度，使蛋白质样品在与它们等电点相应的 pH区域集中，等电点不同的蛋白质泳动后形成位置不同的区带而得到分离。 双向电泳 由第一向等电聚焦 (IEF)电泳和第二向 SDS-PAGE 组成，第一向使 等电点不同 的蛋白得到分离，第二向使 分子量不同 的蛋白得到分离，两向结合便得

30、到高分辨率的蛋白图谱。 免疫印迹法 蛋白质转移到膜上 ，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 蛋白质结晶的原理以及其与盐析有何区别 原理： 蛋白质溶液在合适的过饱和状态，溶质分子通过扩散、旋转、碰撞等运动形式，可以形成晶整理：许智润 2011 年末考试覆盖率 100% 10 核。溶质分子以相互碰撞的作用方式有序而反复地堆砌在晶核上，直到晶核成长到晶体，最后从溶液中析出。 与盐析有何区别： 蛋白质的结晶无选择性，要求纯度高，对其他条件相对要求多，反复结晶目的是纯化； 盐析也是利用蛋白质结晶的原理，但是其目的主要是用于分

31、离蛋白质，且要求蛋白 质浓度不能过高，否则容易出现多种蛋白质共沉淀。 个人补充： 蛋白质的定量 定氮法测量蛋白质含量：蛋白质含量（每克） =每克生物样品中含氮的克数 X 6.25 双缩脲法：双缩脲反应形成紫色或紫红色的络合物， 540 nm 处进行比色测定。（此反应为肽及蛋白质特有的，而为氨基酸所没有的一个颜色反应） 紫外吸收法（略） 蛋白质的纯度标准的检测 电泳、层析、蛋白质化学结构分析等 第三章 蛋白质一级结构测定 蛋白质一级结构测定的基本方法和基本策略 一级结构（序列）测定的基本方法： 将肽段用 不同方法专一性地切断 ,将得到的 肽段分离纯化之后 ,分别测出 各自的 序列 。再将不同方法

32、得到的序列进行 比对 ，就可以得到肽链的一级结构。 序列测定一般步骤： 纯度要求 :纯度在 97%以上。 双向电泳；凝胶电泳； N-末端测定；纯化至恒定酶活； 肽谱分析。 分子量测定 多肽链的组成，二硫键的断裂。 蛋白质的氨基酸的组成。 蛋白质的配基 蛋白质的端基分析 进行正常的序列测定 蛋白质的水解： 酸水解： Trp 被沸酸完全破坏；有 -OH 的 Ser 或 Thr 小部分被分解； Asn 和 Gln 侧链的酰胺基 -COOH；不容易引起水解产物的消旋化。 碱水解：水解 产物发生消旋化，许多氨基酸都受到不同程度的破坏， Trp 在水解中不受破坏。 磺酸水解：环境需中性，条件苛刻，水解液碳水化合物较多时，色氨酸易被破坏；中性水解液可以直接上机，色氨酸稳定。 酶水解：水解不稳定的氨基酸；不容易彻底水解，酶自溶污染产物。