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口腔微生物学笔记修.doc

1、 - 1 - 口腔微生物学 绪论 内容提要 一、 口腔微生物学的发展历史 二、 口腔微生物生态学基础 一、 口腔微生物学的发展历史 1676 年 Van Leeuwenhoek 牙面标本的小动物 1890 年 W.D.Miller“化学 寄生学说”酵解 糖产酸致龋 1897 年 GV Black、 Williams 首先提出牙菌斑的概念 1986 年 至今 口腔微生物组、口腔生态学、菌斑生物膜、致病机制、新种属、抗菌药物与制剂、防龋疫苗、新方法学等 细菌学家 Koch 对微生物学的奠基性贡献 1、 细菌分离、鉴定技术 2、 发现结核杆菌 3、 病原微生物确定标准 Koch 法则 必须从病灶位分

2、离到同一种病原体 该病原体能在体外培养并传代 培养出的病原体能使易感动物发病,并从发病的动物继续分离培养出该病原体 W.D.Miller: 1890 人类口腔中的微生物“化学细菌学说” “化学 细菌学说” 牙菌斑由微生物组成在大量摄入糖类食物的易感宿主中,菌斑微生物将糖类转化为酸,这些算导致牙齿脱矿,提出去除菌斑是口腔疾病治疗的基础 牙菌斑( dental plaque) 细菌沉积物 细菌为主体的生态系统 相互集聚、物质代谢交流和信息交流 可致牙体牙髓病和牙周病 19501980 年代的口腔微生物学发展 近代口腔微生物学的发展 生物膜 基于 16SrRNA 的分子生物学检测 片段克隆测序 片段

3、 DGGE 分离 整个群落直接测序(宏基因组学) 454sequencing technology 其他组学研究 - 2 - 生物膜( biofilm) 基质包裹 相互粘附并附着于体表或界面 微生物群体 三维立体结构 16SrRNA 高度的保守性和特异性 变性梯度凝胶电泳 DGGE 宏基因组测序 通过口腔微生物的宏基因组研究菌群结构和功能变化,筛选与相关疾病关联的显著物种或基因,对疾病进行早期 预警、干预、治疗,为疾病的预防和治疗奠定了基础 二、 口腔微生物生态学基础 1、 口腔生态系( oral ecosystem) 生态学( Ecology): 研究生物体与其环境的相互依赖和相互制约的科学

4、称为生态学 生物体与环境 生态系统与环境系统 生态系( ecosystem): 生物之间、生物与其环境之间的空间构成称为生态系 生命因子:细菌、真菌、病毒、原虫等 生态系统 无生命因子:微生物与其宿主的代谢产物和细胞裂解物、微环境的温度、生物化学与生物物理学特征、营养、 水分 口腔生态系( oral ecosystem) 口腔生态系由两大部分组成,即生态区(口腔组织器官:包括齿、舌、颊、腭、牙、牙龈、牙槽骨、龈沟及唾液等多个小生态区)和口腔中的各种微生物群 1.1 口腔生态区 定义:空间层次、栖息地 组成:生境 habitat、生态点 biotopes、生态位(生态龛) niche 口腔生态区

5、 包括齿、舌、颊、腭、牙龈、牙槽骨、龈沟及唾液等多个小生态区。对不同个体而言,口腔生态区还包括修复体(活动或固定义齿、种植义齿)及矫治器等。 牙生态区 :每颗牙齿都是由牙冠和牙根组成的。牙 冠暴露在口腔中,牙根则包埋在牙槽骨中。牙冠表面不同的几个面,构成环境不同的小生态区。 小生态区又分为不同的生境、生态点和生态位。 如:舌可分为舌背、舌腹、舌尖和舌根;牙可分为前牙、后牙或切牙、尖牙、磨牙; 同一牙依其解剖结构又包括牙冠、牙釉质、牙本质、牙槽骨、牙髓等; 牙面又可分为唇侧面、舌侧面、颊侧面和邻面 口腔生态区特点 口腔生态环境因其特殊的解剖位置及组织学特点而存在与机体其他生态环境明显不同的特点。

6、 温度: 口腔生态区温度的恒定( 36 37)来源于全身体温的调节,有利于绝大多数细菌的生长繁殖。 由于从口腔摄入食品的温度可变动在 60( -555)左右,因此细菌必须适应 60的温差才能在口腔长期生存 滞留区 :滞留区多是口腔生态区的一个重要特点,包括龈沟、牙邻面间隙、 牙合 面的窝- 3 - 沟、义齿卡环和基托与牙面或牙龈、颊黏附的接触区等。口腔卫生措施不易到达, Eh较低。 氧化还原电势 Eh:差异和变化大,是口腔微生物种类复杂、数量多的重要原因之一。 pH:氢离子浓度反映为 pH 值,口腔唾液 pH5.67.6。影响口腔局部 pH 的因素:外源性(食物、药物)、细菌代谢、唾液缓冲 营

7、养源 :口腔生态区中有着丰富的营养物质,包 括宿主进食、唾液、龈沟液、脱落的上皮细胞以及细菌产生的生长因子等,为口腔微生物的生长繁殖提供了基本的营养源。(氯化血红素 hemin牙龈卟啉单胞菌生长) 脱离力 :组织表面上皮细胞的代谢、死亡脱落 食物咀嚼、吞咽、刷牙、含漱 唾液、龈沟液的流动洗刷 是影响口腔生态环境微生物定植数量的重要因素之一 2、 口腔正常微生物( oral normal microflora) 与人类在共同进化过程中,经过自然选择,与宿主口腔形成密切共生关系的、在正常生理状况下不致病而且有益的口腔常驻微生物。 2.1 来源 刚出生 的婴儿口腔内无菌,出生后 6h 有少量的细菌,

8、 6-10h 口腔内细菌快速增多;胎儿无菌,产道获得,双亲影响,暂时(大肠杆菌,肠杆菌) 介导( introduction) 与外界的接触,与宿主口腔关系密切的微生物种群 2.2 演替( succession) 在特定环境和时间内数量和种类的变化 生理性演替,病理性演替 在宿主的一定发育阶段及生态区内,在外环境的改变下,特定生态区内定植微生物数量和种类变化的过程称为微生物的演替 剖腹生产的 新生儿 口腔中无菌,经产道生产的新生儿口腔检出的细菌为其母亲阴道正常细菌 新生 儿 口腔以唾液链球菌和缓症链球菌为主,韦荣球菌是最早定植在口腔的厌氧菌 出生后 :母亲、近亲传播 乳牙萌出前( 5 个月内):

9、 数量少,种类简单 定植于黏膜;需氧菌和兼性厌氧菌 出生 1-3 天时主要是“先驱菌” 口腔链球菌、轻链球菌等 3 个月后口腔内有产黑色素普氏菌等厌氧菌(白色念珠菌在新生儿口腔的检出率达 80%) 乳牙列形成时期( 5-32 个月): 牙齿的出现,口腔滞留区增多,增加了细菌定植的环境,口腔细菌的数量和种类增加,利于各种细菌,包括厌氧菌的生长 血链球菌、变异链球菌定植 G+杆菌和 G+丝状菌增多 龋病发生 的第一个高峰期 1 岁:口腔葡萄球菌、链球菌、奈瑟球菌、韦荣球菌; 1/2:放线菌、乳杆菌、梭杆菌 恒牙列形成时期 口腔解剖结构相对恒定,微生物群也达到演替峰顶 是微生物数量最多,种类最复杂的

10、时期 - 4 - 专性厌氧菌增加明显 G-厌氧菌的数量到成年达高峰 青少年 与成人相似,少 G-产黑色的厌氧杆菌 13-16 青少年: G-产黑色的厌氧杆菌;螺旋体;梭杆菌 成人 血链球菌 链球菌 无牙 牙合 血链球菌 变异链球菌 G-厌氧杆菌,假丝酵母菌 不同年龄阶段唾液微生物组 DGGE 图谱:唾液微生物的组成具有个体差异性, 各年龄组共有的菌群数量较多,新生儿口腔中细菌种类明显少于其他年龄组 2.3 种类与特点 种类 细菌、真菌、病毒、支原体、原虫 特点 数量多、种类复杂、细菌为优势种群 生物膜形式存在 互相之间,以及与宿主之间关系密切 3、 口腔微生物的相互关系 共生 正相关关系 栖生

11、 共生关系 互生 助生 竞争 负相关关系 偏生 竞争关系 寄生 吞噬 相互集聚 与黏附 相互营养与生长 相互竞争、拮抗 相互信息交流与遗传多样性 生态平衡和失调 3.1 相互集聚与定植 共聚集、凝集 共聚桥( coaggregation bridge) 3.2 相互营养与生长 - 5 - 3.3 信息交流与遗传多样性 化学信息(物质、能量)交流 遗传信息(基因流)交流 密度感应系统( quorum sensing systems):耐药质粒的传递 3.4 竞争拮抗 竞争:竞争排斥和竞争共处 拮抗:细胞结构和毒性因子 拮抗作用( antagonistic interaction):口腔生境中一种

12、细菌 产生的物质对其他菌种产生的约束和抑制作用。 血链球菌、轻链球菌过氧化氢抑制厌氧菌 通过细菌素对口腔微生物群产生作用。细菌素是细菌所产生的能够影响其他细菌生长的蛋白质(肽类)毒素(抑制) 血链素、变链素、黑色素菌素 3.5 生态平衡与失调 生态学的核心问题:生态平衡( eubiosis)生态失调( dysbiosis) 4、 影响口腔生态系的主要因素 宿主因素:口腔特殊的解剖结构和生理特点;唾液、牙冠表面的沟裂、邻面、龈沟、舌背面等滞留区、牙列状况等均可影响口腔微生物的种类和定植 微生物因素:微生物的种类和 数量;口腔正常微生物群间的相互作用(共生和拮抗)是口腔微生物定植、种类、数量和分布

13、的重要影响因素 环境因素:微生物生长的环境因子或生态因子,如温度、 pH、 Eh、营养物或生长因子等。口腔生境中生态因子的变化也是影响口腔正常微生物群的种类、数量和定植的重要因素 口腔微生物种群 一、 微生物的分类 1.根据微生物的大小、结构、组成等分为三类: 原核细胞型 如:细菌、放线菌、螺旋体、衣原体、支原体、立克次体。 (也称广义的细菌 ) 真核细胞型 如:真菌、原虫 - 6 - 2.细菌的分类 细菌 的分类是根据一定原则对细菌进行分群归类,并根据相似性与相关性的不同水平排列成系统。 分类原则: 细菌表型特征的相似性 和 系统发育的相关性 细菌的分类单元及其等级: 界 (kingdom)

14、、门 (phylum)、纲 (class)、目 (orfer)、科 (family)、属 (genus)、种 (species) 最重要、最基本的单位是 种 ,其次是 属 ,种和属在细菌分类中常用;科及科以上的划分在细菌学中不太完善。 属 (genus):具有共性的若干种的组合,应与其他属有明显的差异 种 (species): 细菌分类的基本单位。生物学性状基本相同的细菌群体构成一个菌种 菌株 (strain):从自然界中分离得到的任何一种微生物的纯培养物都可以称为微生物的一个菌株;对不同来源的同一种细菌称为该菌的不同菌株。同一种细菌可有许多菌株,其主要性状应该完全相同,次要性状可稍有差异,通

15、常用地名或动物名的缩写加编号作菌株名。 标准菌株 (type culture strain):亦称模式菌株,是具有某种细菌典型特征的菌株。 (由于细菌分类单元的划分缺乏一个易于操作的统一标准,为了减少因采用不同标准界定分类单元所造成的混 乱,细菌系统分类也像其他生物分类一样采用“模式概念”。) 培养物 (culture):一定时间、一定空间内微生物的细胞群或生长物。如微生物的鞋面培养物、摇瓶培养物等。 型 (form/type):常指亚种以下的细分。当同种或同亚种不同菌株之间性状差异,不足以分为新的亚种时,可以细分为不同的型。如不同的血清型、噬菌型等。 菌株与型的区别 :菌株之间不存在鉴别性特

16、征的差异,命名不同的菌株无需分类学依据;不同型的细菌之间存在鉴别性特征的差异,命名或鉴定不同的型必须有分类学依据。 3.细菌的命名 国际细菌 命名法规:以“拉丁名称字义命名”的原则,根据双名法: 属名 +种名 +命名人 注:属名的第一个字母必须大写,其余均应小写。整个属名及种名在出版物中应排成斜体。 例: Streptococcus mutans Clarke 1924 几种不同的书写情况: 属名重复出现,可缩写: E.coli(大肠杆菌) 只确定属名,未确定种名的某一株细菌: Salmonella sp. 只确定属名,未确定种名的若干株细菌: Salmonella spp. 亚种用 spp.

17、表示 二、 细菌的鉴定 细菌鉴定 是指借助于现有的细菌分类系统 ,通过特征测定,确定未知的、新发现的或未明确分类地位的细菌所应归属分类群的过程。 细菌的分类鉴定: 一般只有纯培养的细菌才能进行鉴定。 DNA 分子水平的鉴定主要限于专业实验室或做研究之用。常用的鉴别方式有染色鉴定、细胞形态鉴定、生理生化鉴定、血清型鉴定、菌细胞组分分析、遗传与分子生物学鉴定等。 分类依据 举例 细胞形态 外形、革兰氏染色、鞭毛、芽孢、大小、排列方式等 非细胞型 如:病毒、亚病毒、朊粒 - 7 - 菌落形态 颜色、溶血、外形、大小等 生理特性 好氧、厌氧、光合、选择性培养基上生长 发酵碳水化合物 产酸或产气 水解氨

18、基酸 产 氨 酵解产物类型 丁酸盐、乳酸盐、醋酸盐 预制酶 糖苷酶 抗原 对细菌表面蛋白的单克隆或多克隆抗体 脂类 甲基萘醌类、长链脂肪酸 DNA 碱基构成( G+C 比例)、 16S rRNA 序列 酶 有 /无,电泳迁移率 肽聚糖 氨基酸组成 噬菌体分型 哪种噬菌体侵染细菌 三、 口腔微生物种群 口腔微生物的 特点 : 数量多、种类复杂、相互关系密切,细菌是最常见的口腔微生物 。 细菌 (bacteria): 按革兰氏染色性质: G+菌、 G-菌 按形态分为:球菌、杆菌、弯曲杆菌和螺旋体 按氧耐受性分为:需 氧菌、兼性厌氧菌、微需氧菌、专性厌氧菌 古细菌 (archaea):生存在极端环境

19、下(高温、高盐、低 pH),细胞壁无肽聚糖 真菌 (fungus) 病毒 (virus)、支原体 (mycoplasma)、原虫 (protozoa)、衣原体 (chlamydia)等 口腔不同部位常见微生物的分布 部位 优势微生物 唾液 唾液链球菌、缓症链球菌、奈瑟球菌、韦荣球菌、乳杆菌、放线菌 唇 表皮葡萄球菌、口腔链球菌 颊 缓症链球菌 腭 口腔链球菌群、嗜血菌 舌 唾液链球菌、口腔链球菌群、奈瑟球菌 牙 口腔链球菌 群、放线菌、梭杆菌、普雷沃菌、卟啉单胞菌、二氧化碳噬纤维菌 牙龈及龈沟 口腔链球菌群、放线菌、梭杆菌、普雷沃菌、卟啉单胞菌、二氧化碳噬纤维菌、韦荣球菌、螺旋体 义齿及矫正器

20、 口腔链球菌群、假丝酵母菌 1.革兰阳性球菌 1.1.兼性厌氧菌 葡萄球菌属 (Staphylococcus) 金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus):革兰阳性球菌,葡萄状排列,溶血环;触酶阳性,有致病性(凝固酶阳性和甘露醇发酵阳性);是颌面部疖痈、伤口感染和婴幼儿口角炎的病原菌; - 8 - 表皮葡萄 球菌 (Staphylococcus epidermidis):常参与牙周、根管或颌面部混合菌感染,是口腔最常见的葡萄球菌,在牙周炎、感染根管、冠周炎等病灶中可检出; 腐生葡萄球菌 解糖葡萄球菌 性状 金黄色葡萄球菌 表皮葡萄球菌 菌落色素 金黄色 白色 凝固酶 + -

21、 葡萄糖 + + 甘露醇 + - -溶血素 + - 耐热核酸酶 + - A 蛋白 + - 磷壁酸类型 核糖醇型 甘油型 噬菌体分类 多数能 不能 致病性 强 弱 链球菌属 (Streptococcus) 口腔链球菌属 是正常口腔中的优势菌群,检出率 80%,是 口腔数量和种类最多 的革兰阳性的兼性厌氧球菌。 唾液链球菌群 (Saliva streptococcus groups):唾液链球菌、前庭链球菌 唾液链球菌:主要从人和动物的口腔中检出,是舌面和唾液中的正常菌群成分,不被认为是机会致病菌;可产生类细菌素抑制性物质 (BLIS); 缓症链球菌群 (Mitis streptococcus g

22、roups):血液链球菌、口腔链球菌、缓症链球菌 血液链球菌:球形或卵圆形,直径 0.81.2 m;是牙菌斑的主要菌群成分;可产生 对氨基苯甲酸 (PABA),被认为 是变异链球菌定植生长的助生菌 ;可产生 H2O2、血链素 等抗菌物质,也被认为是口腔重要的生理菌和 牙周益生菌 ;是 条件致病菌 ,当拔牙或摘除扁桃体时,细菌可以侵入血液,可能导致心内膜炎或败血症。 变异链球菌群 (Mutans streptococcus groups):变异链球菌、表兄链球菌;表型相同,但血清型和遗传型不同。 变异链球菌:是主要致龋菌:有强粘附力,产酸耐酸,葡萄糖基转移酶 (GTF);主要定植在人口腔的非脱落

23、表面(牙面、义齿表面 ),是龋病的主要病原菌,可导致菌血症、心内膜炎等继发性感染。 肠球菌属 (Enterococcus) 口腔球菌属 (Stomatococcus) 颗粒链球菌属 (Granulicatella) 孪生球菌属 (Gemella) 1.2.革兰阳性厌氧球菌 消化链球菌属 (Peptostreptococcus) 微小消化链球菌:条件致病菌,常参与口腔内的混合菌感染;牙周炎的主要龈沟菌群成员之一,被视为破坏性牙周炎的主要可疑病原菌之一;该菌亦可以从口腔其他混合菌感染,以及健康口腔的龈沟和龈上菌斑中检 测出。 肠球菌属 (Enterococcus) - 9 - 粪肠球菌:人体的上呼

24、吸道、口腔或肠道的常驻菌;根管治疗后继发感染的主要病原菌之一,检出率约 80%;可在根管壁及根尖孔外形成生物膜。 消化球菌属 (Peptococcus) 解糖葡萄球菌 2.革兰阳性无芽孢厌氧杆菌 放线菌属 (Actinomyces) 生物学特性: G+杆菌;口腔正常菌群成员,是邻面牙菌斑的主要成分,与根面龋有关。 常见菌种: 黏液放线菌:主要定植与龈下菌斑、龈缘菌斑和牙石,是致龋菌之一。 衣氏放线菌:机会致病菌,可导致颌面部及其他 部位放线菌病。 内氏放线菌:主要定植与口腔扁桃体和牙菌斑。 溶牙放线菌 真杆菌属 (Eubacterium) 又名优杆菌属 生物学特性: G+杆菌,无芽孢,专性厌氧

25、杆菌 常见菌种: 迟缓真杆菌:主要定植于肠道。 砂真杆菌、不解乳真杆菌:正常口腔中检出率较高的真杆菌,主要从牙周袋和脓肿中检出;不解乳真杆菌为条件致病菌。 短真杆菌、缠结真杆菌:可疑牙周致病菌。 丙酸杆菌属 (Propionibacterium) 乳杆菌属 (Lactobacillus) 生物学特性: G+杆菌,厌氧或微需氧,无芽孢杆菌; 是人和动物肠道中最常见和最重要的正常菌群成员,对维护健康有重要意义。 常见菌种: 干酪乳杆菌:经常从龋损部位检出,被视为致龋菌。也作为调节人体肠道的益生菌。 嗜酸乳杆菌、发酵乳杆菌 双歧杆菌属 (Bifidobacterium) 3.革兰阴性球菌 3.1.革

26、兰阴性厌氧球菌 韦荣菌属 (Veillonella) 生物学特性: G-球菌,厌氧,直径 0.30.5 m 常见菌种: 小韦荣菌:可从唾液、舌面、牙菌斑等标本中检出,可利用乳酸产生较弱的丙酸,被认为是牙菌斑中的有益菌,也是肠道正常菌群 之一。 3.2.革兰阴性需氧和兼性厌氧的球菌 奈瑟球菌属 (Neisseria) 生物学特性: G-菌,需氧,双球菌;是牙面的早期定植菌之一,通过在牙菌斑中消耗氧气为其他厌氧细菌提供生长条件,在牙菌斑的形成中起重要作用;大多数属于正常菌群成员,一般无致病性。 常见菌种:干燥奈瑟菌、乳糖奈瑟菌、微黄奈瑟菌、灰色奈瑟菌、长奈瑟菌 黏膜炎莫拉菌 (Moraxella

27、catarrhalis) 生物学特性:形态学类似奈瑟球菌属,也叫卡他奈瑟球菌,但该菌与奈瑟球菌的 DNA 碱- 10 - 基组成含量及脂肪酸组成有差异;是脑 膜炎、心内膜炎、中耳炎和上颌窦炎的机会致病菌。 4.革兰阴性杆菌 4.1.兼性厌氧菌 嗜血菌属 (Hemophilus) 生物学特性: G-兼性厌氧杆菌 常见菌种: 副流感嗜血菌:一般不致病,但可作为条件致病菌。 嗜沫嗜血菌、副溶血嗜血菌 二氧化碳噬纤维菌属 (Capnocytophaga) 生物学特性: G-兼性厌氧杆菌,可滑动;是人和灵长动物的正常菌群成员,主要定植于口腔。 常见菌群:牙龈二氧化碳噬纤维菌属,生痰二氧化碳噬纤维菌属 艾

28、肯菌属 (Eikenella) 生物学性状: G-兼性厌氧 杆菌,无芽孢;血琼脂培养基表面可形成侵蚀性和非侵蚀性两种不同的菌落;与牙周病有关。 常见菌种:啮噬艾肯菌 弯曲菌属 (Campylobacter) 4.2.革兰阴性无芽孢厌氧杆菌 卟啉单胞菌属 (Porphyromonas) 牙龈卟啉单胞菌 (Porphyromonas gingivalis):杆状或球杆状,不分解糖类,有菌毛介导黏附;为 主要牙周致病菌 ,也是牙髓根尖周感染致病菌。 坦纳菌属 (Tannerella) 普雷沃菌属 (Prevotella) 中间普雷沃菌 :主要定植于龈沟,可能是妊娠期 牙龈炎的主要病原菌。 产黑色素普

29、雷沃菌:分离自龈沟和一些临床标本 梭杆菌属 (Fusobacterium) 生物学特性: G-长梭杆菌、无芽孢、无动力;可以和大部分的口腔细菌发生共聚,是早期和晚期牙面黏附菌的重要桥梁;是人和动物体内正常菌群的成员,部分可作为条件致病菌。 代表菌种:具核梭杆菌 纤毛菌属 (Leptorichia) 月形单胞菌属 (Selenomonas) 生物学特性: G-杆菌、活泼动力、专性厌氧菌、弯曲或螺旋形的杆状。 另:产黑色素革兰阴性厌氧杆菌群: 产生黑色素 黑色菌落 恶 臭味培养物 代谢酸为丁酸或乙酸 发酵碳水化合物及产生靛基质试验 代表菌种:牙龈卟啉单胞菌、中间普雷沃菌 4.3.革兰阴性芽孢杆菌 需氧芽孢杆菌属:芽孢杆菌属 (Bacillus) 厌氧芽孢杆菌属:梭菌属 (Clostridium)

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