人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析.docx

1、西南大学 细胞生物学自主实验 课程论文 论文题目： 人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析 学院：生命科学学院 专业：生物科学 年级班级： 2010 级 5 班 校区编码：北区 学号： 222010317011128 姓名：陈建坤 二零一二年十二月四 日 人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析 10 级生科 5 班 3 组 陈建坤 学号： 222010317011128 【 摘要 】 ：染色体是遗传物质的载体，它具有贮存和传递 DNA、控制基因活动和 调整基因重组的作用。本文着重介绍通过对人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析，初步了解到对人体外周血淋巴细胞培养方法与人类体细胞染色体核型分析的

2、方法。该实验采用人工离体培养的方法，采集人体外周血淋巴细胞，在加有植物血球凝集素（ PHA，刺激小淋巴细胞转化为淋巴母细胞而进行有丝分裂）的培养基中培养。经过（ 72 2）恒温培养，秋水仙素处理、低渗和固定，获得大量有丝分裂中期细胞。最后 经过空气干燥法制片， 对 人 体外周血淋巴 细胞进行染色体核型分析。 【 关键字 】 ：人体外周血淋巴细胞 染色体核型 人工离体培养 一 引言 : 染色体是遗传物质的载体，它具有贮存和传递 DNA、控制基因活动和调整基因重组的作用。人类染色体核型分析是将人的一个体细胞有丝分裂中期的染色体，在技术的基础上，按照染色体的大小和形态特征（主要根据着丝点位置），对染

3、色体进行分组、排队和配对。这对于探索人类遗传病的发病机理，探讨动物和植物的起源，以及物种间的亲缘关系等都具有重要意义。直到上世纪 50 年代，科学家对染色体本身的细致深入研究才成 为可能。染色体组型分析是细胞遗传学研究的基本方法，是研究物种演化、分类以及染色体结构、形态与功能之间，人类 G 显带核型图谱关系所不可缺少的重要手段。 1952 年徐道觉用低渗法使细胞膨胀，使染色体充分分散开来。 1956 年， Tjio 等用秋水仙素使细胞分裂固定在分裂中期，增加了细胞分裂相。之后，有科学家建立了人体外周血培养法，使得染色体取材变得更加容易，大大推动了人类对染色体的研究。 二 人体外周血淋巴细胞培养

4、与染色体核型分析 1.实验依据 ： 1.1.细胞培养是在体外模拟体内的生理环境，培养从机体中取出的细胞，并使之生存和生长的技术为细胞培养技术。要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必需的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度和渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。 1.2.染色体是组成细胞核的基本物质 , 是基因的载体。 人类细胞遗传学研究的主要对象是染色体。本实验采用了 微量全血培养技术，既方便又节省人力物力。在正常情况下 , 人外周血中是没有分裂相的 , 只有在异 常情况下才能发现。 植物血细胞凝集素

5、 (PHA) 是人类淋巴细胞有丝分裂的刺激剂 ,在 PHA 作用下 , 原处于 G0 期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞 , 进而进行有丝分裂。 利用 PHA 这一特性 , 淋巴细胞经过含有 PHA 培养液培养 , 在体外便可获得丰富的含有丝分裂的生长活跃的细胞群体 , 终止分裂中期的淋巴细胞 , 经过短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可获得大量的中期有丝分裂细胞。最后经空气干燥法制片，便可得到质量较好的染色体标本。即可得到所需的人体染色体图形。 染色体组型，又称核型，是指将动物、植物、真 菌等的某一个体或 某一分类群（亚种、种、属等）的体细胞内的整套染色体，按它们相对恒定的特征排列起来的图像

6、。核型模式图，是指将一个染色体组的全部染色体逐个按其特征绘制下来，再按长短、形态等特征排列起来的图像。 染色体组型分析就是通过对染色体标本和其照片进行测量、对比分析、配对、分组、排列，对各染色体的形态进行分析。在细胞遗传学、现代分类学、生物进化和遗传育种学等研究中，是重要的研究手段。 1.3.对于任何一个染色体的基本形态特征来说，重要的参数有以下 3 个： （ 1）相对长度 =单条染色体的长度 /(单倍体常染色体 +X 或 Y 染色体 )的总长度 100% （ 2）臂指数 =长臂 /短臂 （反映着丝粒位置的指数） （ 3）着丝粒指数 =短臂 /整个染色体长度 100%（反映着丝粒位置的指数）

7、人类体细胞的正常核型是含有 23 对染色体，共 46 条。其中 22 对是男女共有的染色体，一对为男女所不同的性染色体，男 XY,女 XX。 表 -1 人类染色体组型 群组号 染色体号 形态大小 着丝粒位置 随体 次缢痕 鉴别程度 A 13 最大 M 无 常见 1 号 可鉴定 B 45 次大 Sm 无 不易 C 612+X 中等 Sm 无 常见 9 号 难鉴定 D 1315 中等 St 有 偶见 13 号 难鉴定 E 1618 较小 16m,17m 和 18m 无 常见 16 号 可鉴定 F 1920 小 M 无 不易 G 2122+Y 最小 st 有、 Y 无 难鉴定 正常男性染色体核型 正

8、常女性染色体核型 3、实验仪器试剂及材料： 3.1.材料 ： 人的静脉外周血 . （组内选取男女各一名，取血样） 3.2.试剂 ： RPMI-l640 培养粉 NaHCO3 NaCl PHA(植物血球凝集素 ) 肝素 青链霉素 小牛血清 秋水仙素 95%酒精 冰乙酸 甲醇 甘油 Giemsa 粉末 3.3.器材 ： 恒温培养箱 ,电冰箱 ,高压灭菌锅 ,离心机 ,真空泵 ,分析天平 ,显微镜 ,超净工作台 ,注射器 ,离心管 ,培养瓶 ,试管架及试管 ,量桶 ,烧杯 ,酒精灯 ,抽滤瓶 ,G6 型号细菌过滤漏斗，染缸，滴管等。 4、实验方法： 4.1.各种试剂及培养基的配制 (1)RPMI-1

9、640 基础培养基的配制：称取 RPMI-l640 培养粉 9.8g 溶于 1,000mL 蒸馏水中 ,经 G6 型号细菌过滤漏斗中 0.22 微米的滤膜抽滤后备用。使用前最好做热源培养以确保实验顺利进行。 (2)5%NaHCO3 的配制：称取 5gNaHCO3,溶于 100mL 蒸馏水中 ,高压灭菌备用 . (3)生理盐水的配制：称取 0.85gNaCl 溶于 l00mL 蒸馏水中高压灭菌备用 . (4)PHA(植物血球凝集素 )的配制：称取 PHA50mg 配制成浓度为 lmg/mL(生理盐水配制 )的溶液 .由于 PHA 使用量较少 ,配制时 使用注射器式无菌过滤器 ,以减少药品损失 .

10、 (5)肝素溶液的配制： 40ml 生理盐水溶解粉末 160mg（每 mg 含 126 单位），配制成500 单位 /ml， 8 磅 15min 灭菌。 (6)双抗溶液的配制：将青链霉素用生理盐水按效价单位配成 l0 万单位 /mL,配制过程要求使用注射器式无菌过滤器 . (7)秋水仙素溶液的配制：用生理盐水配制成浓度为 40（微克 /mL）秋水仙素溶液 ,使用注射器式无菌过滤器进行除菌操作 . (8)低渗液溶液的配制：称取 5.59gKCl 溶于 1000mL 双蒸馏水中 ,配制成溶液浓度为0.075mol/L 的 低渗液溶液 . (9)细胞培养 基的配制：在每个培养瓶中加入 RPMIl64

11、0 基础培养基 4mL,小牛血清lmL,肝素 3 滴（ 0.03ml） ,PHA4 滴（ 0.4 ml） , 加入双抗 5 滴（ 0.05ml） ,NaHCO3 调 pH至 7.2 7.4. （ 10）固定液的配制： 9ml 纯酒精 +3ml 冰乙酸 （ 11） Giemsa（吉姆斯）染液（不用配） Giemsa 原液配制：称 Giemsa 粉末 0.5g，加几滴甘油研磨，再加入甘油（使加入的甘油总量为 33ml）。 56中保温 90 120min。加入 33ml 甲醇，置棕色瓶中保存。 4.2 实 验操作方法 1、实验所用药品及器皿的无菌处理 (1) 实验用的所有器皿 ,器具都必须按规定洗净

12、 ,高压灭菌处理备用 . (2) 实验用全部药品都要经高压灭菌或过滤除菌处理 .具有生物活性的药品要经G6 型号细菌过滤漏斗抽滤除菌 ,其它药品可经过高压灭菌。 2.采取血样：去校医院取本组男生和女生各 2 份血样。在无菌条件下，向含有3mlRPMI-1640 培养基的培养瓶中接种 0.18 ml 全血，轻轻摇匀。 3.血细胞培养：将 4 瓶装有血细胞的培养瓶置于 37培养箱中培养 66 72h（在培养期间每天摇动两次），终止培养前 3 4h 加入秋水仙素 15ml，使最终浓度为 0.40.8ug/ml。 4.收集细胞：将培养瓶从温箱取出，用吸管将贴壁细胞冲散均匀， 按下表将液体分装在相应的离

13、心管中 ，以 1000rpm/min 离心 8min，弃上清液。 管号 低渗处理时间 男 1 20min 女 1 20min 男 2 男 2 20min 男 2 25min 女 2 女 2 20min 女 2 25min 5.低渗处理：先加入 1ml 0.075mol/L KCl 溶液，轻轻吹打，使细胞重悬，然后补加 6ml KCl 溶液， 37低渗 20min。（使红细胞胀破，白细胞胀大，染色体空间变大，易伸展，便于观察） 6.预固定：沿管壁慢慢加入 1ml 新配 carnoy 氏固定液，轻轻吹打混匀， 1000rpm/min离心 8min，去上清液。 7.固定：沿管壁慢慢加入 6ml 固定

14、液，固定两分钟后再吹打，用吸管轻轻地吹打，使细胞分散，固定 20min，离心去上清夜。 8.重复固定：取上清液，再重复进行 7 过程。 9.滴片：沉淀物中加入 6 滴固定液，用吸管吹打使其成为细胞悬液；用镊子取预先冰冻的干净载玻片，迅速滴上 2 3 滴细胞悬液，立即用嘴向同 一方向吹气，使细胞分散均匀，然后置酒精灯上微微加热干燥（或空气干燥）。 10.染色：滴有细胞悬液的载片反扣在染色板上，使片、板之间有一缝隙，将稀释后的 Giemsa 染液滴在片隙中，染色 20min（或放于染缸中）；自来水冲洗，吹干。 11.镜检：在低倍镜找到处于中期分裂相的细胞，然后在转至高倍镜下观察 .观察时要使用推进

15、器座标尺记录分散良好的细胞位置，便于重新查找，选择染色体分散好、长度适中、姐妹染色单体清楚的中期分裂相进行显微观察。人类每个体细胞有 46 条染色体，根据染色体的长度和着丝粒位置的不同，可以分成 22 对 常染色体和一对性染色体，男子是 46， XY；女子是 46， XX。 12.染色体组型分析： (1) 在显微镜下找出染色体分散良好、长度适中、姐妹染色单体清楚的中期分裂相进行显微拍摄。 (2) 将显微拍摄放大的照片上的一个细胞的全部染色体分别一条一条剪下。 (3) 根据染色体的长短和形态特征进行同源染色体的目测配对。 (4) 测量出每条染色体短壁和长臂长度，计算出各条染色体的相对长度、着丝粒

16、指数、臂指数，记录原始数据。 (5) 根据测量数据校正目测配对排列结果，进行调整排列。 (6) 把染色体按一定顺序一对一对的排列，排列时注意短臂向上，长臂向下，性染色体单独排列，最后把染色体贴成一完整的染色体核型图。 (7) 翻拍。 5实验结果及分析 5.1.本实验采用国际标准，使用两种方法，依照上表各指标分析染色体组型， 拟图， 结 果如下 男性染色体核型 （ PS） 女性染色体核型 （ PS） 男性染色体核型（手工） 女性染色体核型（手工） 5.2.数据处理： 见下表 男性 染色体 长臂 短臂 臂指数 着丝粒指数 长度 总长 相对长度 臂判断 着丝粒判断 1 1.18 1.1 1.0727

17、27273 0.4824561 2.28 72.01 0.031662269 中 中 2 1.45 1.15 1.260869565 0.4423077 2.6 72.01 0.036106096 中 中 3 1.08 0.93 1.161290323 0.4626866 2.01 72.01 0.02791279 中 中 4 1.08 0.87 1.24137931 0.4461538 1.95 72.01 0.027079572 中 中 5 0.88 0.85 1.035294118 0.4913295 1.73 72.01 0.024024441 中 中 6 0.8 0.74 1.081

18、081081 0.4805195 1.54 72.01 0.021385919 中 中 7 1.25 0.73 1.712328767 0.3686869 1.98 72.01 0.027496181 亚中 亚中 8 1.35 0.72 1.875 0.3478261 2.07 72.01 0.028746007 亚中 亚中 9 1.34 0.8 1.675 0.3738318 2.14 72.01 0.029718095 亚中 亚中 10 1.27 0.76 1.671052632 0.3743842 2.03 72.01 0.028190529 亚中 亚中 11 1.26 0.75 1.6

19、8 0.3731343 2.01 72.01 0.02791279 亚中 亚中 12 1.23 0.73 1.684931507 0.372449 1.96 72.01 0.027218442 亚中 亚中 13 1.23 0.73 1.684931507 0.372449 1.96 72.01 0.027218442 亚中 亚中 14 1.21 0.69 1.753623188 0.3631579 1.9 72.01 0.026385224 亚中 亚中 15 1.2 0.55 2.181818182 0.3142857 1.75 72.01 0.02430218 亚中 亚中 16 1.18 0

20、.6 1.966666667 0.3370787 1.78 72.01 0.024718789 亚中 亚中 17 1.19 0.7 1.7 0.3703704 1.89 72.01 0.026246355 亚中 亚中 18 1.15 0.68 1.691176471 0.3715847 1.83 72.01 0.025413137 亚中 亚中 19 1.13 0.66 1.712121212 0.3687151 1.79 72.01 0.024857659 亚中 亚中 20 1.1 0.63 1.746031746 0.3641618 1.73 72.01 0.024024441 亚中 亚中

21、21 1.09 0.65 1.676923077 0.3735632 1.74 72.01 0.024163311 亚中 亚中 22 0.9 0.46 1.956521739 0.3382353 1.36 72.01 0.018886266 亚中 亚中 23 0.8 0.45 1.777777778 0.36 1.25 72.01 0.0173587 亚中 亚中 24 0.6 0.3 2 0.3333333 0.9 72.01 0.012498264 亚中 亚中 25 1.3 0.4 3.25 0.2352941 1.7 72.01 0.023607832 亚端 亚端 26 1.2 0.3 4

22、 0.2 1.5 72.01 0.02083044 亚端 亚端 27 1.2 0.44 2.727272727 0.2682927 1.64 72.01 0.022774615 亚端 亚端 28 1.23 0.46 2.673913043 0.2721893 1.69 72.01 0.023468963 亚端 亚端 29 1.19 0.43 2.76744186 0.2654321 1.62 72.01 0.022496875 亚端 亚端 30 1.1 0.41 2.682926829 0.2715232 1.51 72.01 0.02096931 亚端 亚端 31 0.87 0.6 1.45

23、 0.4081633 1.47 72.01 0.020413831 中 中 32 0.97 0.56 1.732142857 0.3660131 1.53 72.01 0.021247049 中 中 33 0.65 0.57 1.140350877 0.4672131 1.22 72.01 0.016942091 中 中 34 0.7 0.6 1.166666667 0.4615385 1.3 72.01 0.018053048 中 中 35 0.81 0.6 1.35 0.4255319 1.41 72.01 0.019580614 亚中 亚中 36 0.79 0.5 1.58 0.3875

24、969 1.29 72.01 0.017914179 亚中 亚中 37 0.55 0.42 1.30952381 0.4329897 0.97 72.01 0.013470351 中 中 38 0.67 0.45 1.488888889 0.4017857 1.12 72.01 0.015553395 中 中 39 0.47 0.47 1 0.5 0.94 72.01 0.013053743 中 中 40 0.55 0.51 1.078431373 0.4811321 1.06 72.01 0.014720178 中 中 41 0.96 0.14 6.857142857 0.1272727 1

25、.1 72.01 0.015275656 亚端 亚端 42 0.76 0.11 6.909090909 0.1264368 0.87 72.01 0.012081655 亚端 亚端 43 0.62 0.09 6.888888889 0.1267606 0.71 72.01 0.009859742 亚端 亚端 44 0.6 0.09 6.666666667 0.1304348 0.69 72.01 0.009582002 亚端 亚端 45 1 0.56 1.785714286 0.3589744 1.56 72.01 0.021663658 亚中 亚中 46 0.8 0.13 6.1538461

26、54 0.1397849 0.93 72.01 0.012914873 亚端 亚端 女性： 染色体 长臂 短臂 臂指数 着丝粒指数 长度 总长 相对长度 臂判断 着丝粒判断 1 1.05 0.9 1.166666667 0.4615385 1.95 48.61 0.039409863 中 中 2 1.05 0.95 1.105263158 0.475 2.00 48.61 0.040420372 中 中 3 1 1 1 0.5 2.00 48.61 0.040420372 中 中 4 0.9 0.9 1 0.5 1.80 48.61 0.036378335 中 中 5 0.9 0.8 1.12

27、5 0.4705882 1.70 48.61 0.034357316 中 中 6 0.8 0.75 1.066666667 0.483871 1.55 48.61 0.031325788 中 中 7 1.1 0.5 2.2 0.3125 1.60 48.61 0.032336297 亚中 亚中 8 1 0.4 2.5 0.2857143 1.40 48.61 0.02829426 亚中 亚中 9 1 0.45 2.222222222 0.3103448 1.45 48.61 0.02930477 亚中 亚中 10 0.9 0.45 2 0.3333333 1.35 48.61 0.027283

28、751 亚中 亚中 11 0.85 0.5 1.7 0.3703704 1.40 48.61 0.02829426 亚中 亚中 12 0.85 0.5 1.7 0.3703704 1.50 48.61 0.030315279 亚中 亚中 13 0.8 0.45 1.777777778 0.36 1.30 48.61 0.026273242 亚中 亚中 14 0.8 0.45 1.777777778 0.36 1.20 48.61 0.024252223 亚中 亚中 15 0.7 0.4 1.75 0.3636364 1.10 48.61 0.022231205 亚中 亚中 16 0.8 0.4

29、 2 0.3333333 1.20 48.61 0.024252223 亚中 亚中 17 0.7 0.4 1.75 0.3636364 1.10 48.61 0.022231205 亚中 亚中 18 0.7 0.4 1.75 0.3636364 1.10 48.61 0.022231205 亚中 亚中 19 0.7 0.4 1.75 0.3636364 1.10 48.61 0.022231205 亚中 亚中 20 0.7 0.4 1.75 0.3636364 1.10 48.61 0.022231205 亚中 亚中 21 0.67 0.39 1.717948718 0.3679245 1.1

30、0 48.61 0.022231205 亚中 亚中 22 0.65 0.38 1.710526316 0.368932 1.10 48.61 0.022231205 亚中 亚中 23 0.5 0.3 1.666666667 0.375 0.90 48.61 0.018189167 亚中 亚中 24 0.55 0.35 1.571428571 0.3888889 0.85 48.61 0.017178658 亚中 亚中 25 0.9 0.18 5 0.1666667 1.08 48.61 0.021827001 亚端 亚端 26 0.88 0.17 5.176470588 0.1619048 1

31、.05 48.61 0.021220695 亚端 亚端 27 0.6 0.09 6.666666667 0.1304348 0.69 48.61 0.013945028 亚端 亚端 28 0.69 0.1 6.9 0.1265823 0.79 48.61 0.015966047 亚端 亚端 29 0.66 0.1 6.6 0.1315789 0.76 48.61 0.015359741 亚端 亚端 30 0.65 0.1 6.5 0.1333333 0.75 48.61 0.015157639 亚端 亚端 31 0.5 0.3 1.666666667 0.375 0.80 48.61 0.01

32、6168149 亚中 亚中 32 0.5 0.25 2 0.3333333 0.75 48.61 0.015157639 亚中 亚中 33 0.45 0.25 1.8 0.3571429 0.70 48.61 0.01414713 亚中 亚中 34 0.45 0.25 1.8 0.3571429 0.75 48.61 0.015157639 亚中 亚中 35 0.4 0.2 2 0.3333333 0.65 48.61 0.013136621 亚中 亚中 36 0.35 0.2 1.75 0.3636364 0.60 48.61 0.012126112 亚中 亚中 37 0.35 0.3 1.

33、166666667 0.4615385 0.65 48.61 0.013136621 中 中 38 0.3 0.3 1 0.5 0.60 48.61 0.012126112 中 中 39 0.3 0.25 1.2 0.4545455 0.55 48.61 0.011115602 中 中 40 0.3 0.3 1 0.5 0.60 48.61 0.012126112 中 中 41 0.4 0.1 4 0.2 0.55 48.61 0.011115602 亚端 亚端 42 0.4 0.1 4 0.2 0.50 48.61 0.010105093 亚端 亚端 43 0.4 0.1 4 0.2 0.4

34、0 48.61 0.008084074 亚端 亚端 44 0.4 0.1 4 0.2 0.55 48.61 0.011115602 亚端 亚端 45 0.8 0.45 1.777777778 0.36 1.25 48.61 0.025262732 亚中 亚中 46 0.8 0.45 1.777777778 0.36 1.30 48.61 0.026273242 亚中 亚中 5.3.根据上面的实验图示以及实验数据可知：论采用何种方式处理方式（ PS 或手工），均得到相同的人体染色体组型，人体正常细胞核型含 46 条染色体，相互配对成 23 对。其中22 对为男女共有的常染色体。另一对男 XY，女

35、 XX 为男女所独有的，决定性别的性染色体。 5.4.实验细胞培养过程中，每个培养瓶中均出现血细胞凝集现象，定期的摇动可以将其分散。然而男 1 培养瓶由于摇动的时间以及次数比较少，出现了凝集成血块状的沉淀， 但是并没有对实验结果产生严重影响。在后期的试验中仍可拍到很好地图像 ,如上图男性染色体核型 (ps） 所示 . 5.5.根 据实验所拍到的图像可得知，女 2号、男 2培养瓶所拍到的染色体的分散程度比其他培养瓶的较好。表明低渗的处理时间会对染色体的分散程度产生影响，低渗 25min的效果比低渗 20min 的效果好。 5.6.相比其他组所拍到的染色体，我们组的染色体明 显较短。原因是 其他组

36、加入秋 水仙素的时间比我们早，他们的染色体大多是处于分裂晚前期和早中期； 我们组加的秋水仙素的量比较多，对染色体产生了影响。 6影响实验的事项： 6.1.外周血的采集：采血接种时不要加入太多 的肝素。肝素过多可能引致溶血和一些淋巴细胞转化和分裂。接种时，若血液过少，获得的淋巴细胞少；而接种过多，淋巴细胞增殖不良，染色体稀少。 6.2.培养基 ：培养基的质量在影响染色体质量方面最为关键，从营养不良的培养基中获得的细胞所制备的染色体质量差，不利于染色体核型分析 。 6.3. 细胞培养：细胞培养阶段也是极为关键的一步，细胞的旺盛生长与培养时间、温度、 CO2 浓度等条件。培养时间以（ 72 2） h

37、 为宜，时间过长或过多，得到的染色体质量都不符合要求。淋巴细胞培养的适宜温度为（ 36 0.5） ，偏离这一温度范围， 细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。 如果温度高于 37 ,细胞的生长速度减慢；如果温度高于 40 ，细胞受损，超过 43 ，则导致细胞死亡。 气体是人体细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有 O2、 CO2。 CO2 既是细胞代谢产物，也是细胞生长繁殖所需成分，它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的 PH 值。 大多数细胞的适宜 PH 为 7.2 7.4,培养基的 PH 值也应调整到 7.2 7.4 偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响。 偏酸性时细胞发育不良，偏碱性

38、时细胞会出现轻度固缩 。 培养箱的温度和 CO2 浓度应严格控制在 (37 0.5） 、 5 以获得良好的中期分裂相。 6.4. 秋水仙素与作用时间 ： 秋水仙素作为细胞培养中的纺锤体阻断剂，可使分裂象细胞停留在分裂中期而获得大量分裂中期染色体以便于核型分析。加入秋水仙素的剂量、作用时间与处于分裂中期细胞数量、染色体长短密切相关。加入的秋水仙素过量、作用时间过长，染色体浓缩，不利于分析；若加入的秋水仙素量不足、作用时间过短，则染色体细长或无染色体，同样不利于核型分析。只有适量的秋水仙素与适量的作用时间，才能获得较好的分裂象。 6.5. 离心力与低渗时间 ： 将培养物收集到 15 ml 的离心管

39、中，通过离心获得需要的细胞。 整个过程中，离心力的大小很关键。 离心力过大会导致细胞之间粘连过紧，低渗时细胞不能被充分混匀，影响低渗效果。 用渗透压很低的盐溶液或蒸馏水处理活细胞，使得细胞长大而不破裂，使得最后制成的片子染色体充分散开。低渗处理的时间过长或过短，都不利于后期染色体的分散，一般以 20 25min 分钟为宜。 【 参考文献 】 1、李国珍： 染色体及其研究方法 . 科学出版社 . 1985. 第 170-176 页 2、刘国章等： 1987. 遗传， 9(3): 26-27. 3、陈心陶 : 医学寄生虫学 (修订第二版 ).人民卫生出版社 . 1965.第 330-333 页 . 4、李红燕，王金富 禽类染色体组型研究进展【 J】 .畜牧生产 . 2006 15 (3 )： 25 -27. 5、吴艳萍 . 核型异常与疾病关系的分析【 J】 .现代预防医学 2007， 34(18 )： 34(80) 6、雷雪芹 ,孙美玲，雷初期，等 安哥拉山羊染色体核型分析【 J】畜牧兽医 杂志 .2001 20 (6 )： 10 -11 7、翟中和，王喜忠，丁明孝 . 细胞生物学 (第三版 ). 高等教育出版社 .2011.12.