蜂蜜抑菌活性检测方法比较研究——毕业论文.doc

1、 湖 南 农 业 大 学 全日制普通本科生毕业论文 蜂蜜抑菌活性检测方法比较研究 COMPARATIVE STUDY ON DETECTION METHODS OF ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF HONEY 学生姓名： 学 号： 年级专业 及 班级： 食品质量与安全 指导老师及职称： 学 院： 食品科 学 技 术 学院 湖南 长沙 提交日期： 年 月 目 录 摘要 . 1 关键词 . 1 1 前言 . 1 1.1 选题背景 .2 1.1.1 蜂蜜功能 .2 1.1.2 蜂蜜产业现状 .2 1.1.3 蜂蜜 研究现状 .3 1.2 研究 目的 .3 1.3 研究方法 .3

2、1.4 研究 意义 .4 2 材料与方法 .4 2.1 试验 材料 .4 2.1.1 供试菌种 . 4 2.1.2 供试蜂蜜 . 4 2.1.3 主要仪器、器皿及用品 . 4 2.1.4 培养基 . 5 2.2 方法 . 5 2.2.1 菌种的活化及菌液的制备 . 5 2.2.2 试验平板的制备 . 5 2.2.3 抑菌 试验 . 5 2.2.4 抑菌圈大小测量 . 6 2.3 试验 方案 . 6 2.3.1 蜂蜜蜜源对其抑菌活性地影响研究 . 6 2.3.2 试验平板制作方法的 比较研究 . 6 2.3.3 试验最适菌及其最适浓度研究 . 6 2.3.4 蜂蜜抑菌活性检测方法比较 . 6 3

3、 结果与分析 . 7 3.1 蜂蜜抑菌活性与蜂蜜蜜源的关系 . 7 3.2 试验平板制作方法比较 . 7 3.3 试验平板中最适菌体浓度试验结果 . 8 3.4 蜂蜜抑菌活性检测方法比较结果 .11 4 结论 . 13 参考文献 . 13 致 谢 . 14 1 蜂蜜抑菌活性检测方法比较研究 摘 要： 通过比较试验实际操作和结果，获得最佳蜂蜜抑菌活性检测方法，为同行在进行蜂蜜抑菌圈研究选择方法时提供参考 。本试验比较了 四种蜂蜜，两种试验平板制作方法，三种供试菌， 5种 浓度的 供试菌 菌液，以及 K-B 法、牛津杯法、打孔法三种抑菌活性检测方法 。 结果表明：洋槐蜜有抑菌活性，用预加菌液倾注平

4、板法制作试验平板、接种 菌落数量级约 为 110 2 CFU/mL 的大肠杆菌 菌液 、采用 K-B 法做定性试验、打孔法做定量实验为检测蜂蜜抑菌活性的最佳方案。 关键词： 蜂蜜；抑菌活性；检测方法；比较 ； The comparative study on test method of antimicrobial activity of honey Abstract: The test was to get the best test method of antimicrobial activity of honey by comparing the tests pratical exper

5、ience and result . That way would play a key role in chosing test method of antimicrobial activity of honey in future .The test compared four honey、 two making method of test plate、 three test bacteria 、 five concentrations and three detection method of bacteriostasis activity including K-B method ,

6、 punch method and oxford cup method. Finally the results show that acacia honey have antimicrobial activity .Using preloading bacteria liquid poured-plate method to make test plate、inoculating Escherichia coli whose colony quantity is about 1102 CFU/ML、 using K-B method to do qualitative test , and

7、the best test scheme、 and using punch method to do quantitative test is the best test scheme of antimicrobial activity of honey. Key words :honey; antimicrobial activity ;test method ;comparation 1 前言 1.1 选题背景 1.1.1 蜂蜜功能 蜂蜜 是 蜜蜂 从植物 的花中采得的 花蜜 在 蜂巢 中 酿制 的蜜 ， 是人类传统而古老的天2 然食品和医疗药品 ,食用和药用历史悠久。蜂蜜营养丰富、功能强

8、大：蜂蜜中含有丰富的碳水化合物、蛋白质以及少量却优质的维生素、多酚类物质和矿物质，老少皆宜。蜂蜜功能多样，例如蜂蜜具有良好的抑菌活性及抗氧化能力，还可以润肠通便、促进酒精分解 1。其中抑菌活性是指某些物质所具有的抑制或杀灭病原微生物的能力。在古代，蜂蜜的抑菌功效早就得以验证，如蜂蜜是世界上唯一不会腐败的天然 食品；又如 4500 年前人类就将蜂蜜的抑菌活性应用于伤口治疗，从轻微皮肤感染到刀剑导致的严重割伤，蜂蜜不仅能促进伤口愈合，而且还能减轻伤者的疼痛 2；又如明代医学家李时珍在本草纲目中对蜂蜜的记载为 :蜂蜜主要用于治疗心腹邪气和各种痢疾，弥补五脏计等的不足，增加并补足气，止痛解毒，医除各种

9、疾病，调和多种药，长期服用可以强身健体，不容易饥饿，也不容易衰老，延年益寿，其入药的功效有五个 :清热 , 补中气 , 解毒 , 润燥 ,和止痛 3。近年 , 国内外的许多学者也已经通过各种试验论证证实了蜂蜜强大的抑菌功能。如通过临 床指证，蜂蜜在治疗皮肤烧伤或溃烂方面效果显著；又如麦卢卡蜂蜜（ Manuka honey）被证实因其具有独特的抑菌活性物质 独麦素，而具有优越的抑菌活性，备受广大消费者的喜爱，是世界上迄今为止发现的两种医疗级蜂蜜之一，被称为新西兰的 “国宝 ”4。 1.1.2 蜂蜜产业现状 另一方面，麦卢卡蜂蜜抗菌活性的研究及其开发利用的成功非常值得我们借鉴，我国养蜂已有 200

10、0 多年历史，是蜂蜜生产大国、消费大国及出口大国。我国地域广阔、蜜源丰富、人口众多，随着人民生活水平的提高，蜂蜜国内消费市场巨大。同时，我国也是世界上第 一蜂蜜出口大国，中国蜂蜜占世界蜂蜜总产量四分之一以上。然而中国虽为蜂蜜大国，但同时也存在许多问题，假蜜盛行、蜂产品价格严重低估是其中最大问题。不仅损坏了蜂农的实际利益，也降低了蜂蜜企业加工技术的投入，失掉市场优势，削弱了中国蜂产品的市场竞争力 5-6。当前虽然我国国家质检总局和国家标准委于 2011 年批准发布了 GB14963-2011食品安全国家标准 -蜂蜜国家标准，要求企业必须无条件执行，但是仍有很多不良企业用糖浆、甜味素、食用果胶等调

11、制出来的成本只有几块钱的假蜂蜜不仅能够顺利通过国家的标准检测，而且 比真蜂蜜更甜更粘稠，以 “低价竞争 ”的方式打乱市场。因此国内市场假蜂蜜依旧盛行 7。消费者没有实用的标准作为参考，仅凭观察、品尝，来鉴别蜂蜜的真假、质量的好坏是相当难的。由于假蜜泛滥所导致的消费者对蜂蜜产品的不信任，国内的蜂蜜市场情况不容乐观，但事实上蜂蜜产品其实有着稳定的消费需求和巨大的市场容量，仍然有巨大的消费空间尚待开发 8。因此研究如何辨别蜂蜜的真假和好坏对于我国蜂产品消费市场的开发十分3 重要，而且研究蜂蜜独特的抑菌活性是现如今最认可的辨别蜂蜜的真假和好坏的方向。 1.1.3 蜂蜜研究现状 迄今为止 蜂蜜的抑菌活性

12、机理的研究有了一定的进展 ,影响蜂蜜抑菌活性的因素主要有两个方面 : 一是蜂蜜的物理特性：如蜂蜜的高渗透压和低酸碱度对大多数菌而言，均不适合其生长。二是蜂蜜中所含有的抗菌成分；抗菌成分主要可以划分为过氧化氢类和非过氧化氢类，过氧化氢类通过氧化作用抗菌 ,非过氧化氢如溶菌酶、苯酚类化合物和黄酮类化合物，可以分别通过各种不同的途径抗菌 9。 然而至今为止，蜂蜜的抑菌机制仍然有许多不明白的地方需要进一步研究。目前，国际上围绕蜂蜜抑菌机制的研究越来越多。因为抑菌试验几乎是研究蜂蜜抑菌机制的必经步骤，因此蜂 蜜抑菌试验方法选择的研究十分重要。抑菌试验是指在体外通过试验测定样品抑菌能力的一种试验。抑菌试验

13、中最常用的方法是抑菌圈法，抑菌圈法又叫扩散法，是利用待测样品在培养基中扩散使其附近的细菌成长受到抑制而形成一个透明圈，即抑菌圈，根据所形成的抑菌圈大小来判定待测药物抑菌效果的一种方法。抑菌圈法不仅操作简单、试验成本低、而且成效好，高精度，因此被普遍使用。目前抑菌圈研究法中使用最多的主要有 K-B 法（ Kirby-Bauer test）、牛津杯法和打孔法三种。 K-B 法即滤纸片法，选用质地均匀的滤纸，灭菌后烘干，浸入待测 样品中， 然后放置于平板培养基中培养 1624h 后测定抑菌圈大小的一种方法。牛津杯法又称杯碟法，选用一定大小的牛津杯，灭菌后烘干，放置于试验平板中，然后往牛津杯中注入一定

14、量的待测样品，培养 1624h 后测定抑菌圈大小的一种方法。打孔法又称平板打孔法，是指选用一定孔径大小的打孔器，灭菌后烘干，然后在培养基上打孔，往孔中注入一定量的待测样品，培养 1624h 后测定抑菌圈大小的一种抑菌活性检测方法 10-11。 1.2 研究目的 正因为抑菌试验方法多，研究蜂蜜抗菌机制时，抑菌活性检测方法的选择是一个比较麻烦的问 题，因此本试验就是以获得蜂蜜抑菌活性最佳检测方法为研究目的的。 1.3 研究方法 本次试验 通过比较 荆条花蜜、长白山椴树蜜、五倍子蜜、洋槐蜜 四种 供试蜂蜜 ，预加菌液倾注平板法、涂平平板法两种试验平板制做方法， 大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌

15、这三种供试菌， 以十倍比 稀释成五个浓度梯度的待测菌液， 以及 K-B法、牛津杯法和打孔法 3 种抑菌 活性 检测方法，获得蜂蜜抑菌活性 最佳检测 方法 . 1.4 研究意义 本试验 以期为同行在进行蜂蜜抑菌 活性 研究选择方法时提供参考 。 首先有利于通4 过蜂蜜抑菌效果强弱的比较，对蜂蜜质量 进行分级，为蜂蜜质量划分标准 。 其次对于未来蜂蜜抗菌机制的进一步研究十分有用 ， 有利于促进新兴蜂蜜保健品的开发，让蜂蜜的商业价值得以更好的发掘和利用。如利用其抗菌、促进伤口愈合、减轻伤者疼痛的作用，可以更加充分地利用其在外科创伤治疗方面的价值，或者将其直接应用到抗炎抗菌药物地开发中，开发针对治疗耐

16、药菌的药物 12。 目前抑菌试验研究比较多的有天然活性物质、中药材提取物和抗生素类等物质，其抑菌性能在药品、功能食品、保健品和化妆品等行业 都 是一个重要指标。抑菌活性对于蜂蜜来说 因此也 是一个相当重要的指标。抑菌活性好的蜂 蜜不但具有作为天然的药品、保健品的应用价值， 而且 还可以作为抗菌新药源具有更大的开发空间，来解决现如今抗生素的大量使用带来了细菌的抗药性这一时代问题。然而目前文献中对于蜂蜜的抑菌机制研究较多，对于蜂蜜抑菌活性检测方法的研究较少，事实上找到一种最方便快捷准确的抑菌活性检测方法，对于日后蜂蜜抑菌机制的进一步研究是十分有益的， 将 为日后蜂蜜抑菌试验省时省力。 2 材料与方

17、法 2.1 试验 材料 2.1.1 供试菌种 由 14 教 311 试验室提供 的 大肠杆菌 （ E.coli） 、金黄色葡萄球菌 (S. aureus)和枯 草芽孢 杆菌 (B. subtilis)。 2.1.2 供试 蜂蜜 本 试验 所使用的蜂蜜皆是由张家界供销云商股份有限公司 提供的 、 经过 加工 炼制过的熟蜜。包括：荆条花蜜、长白山椴树蜜、五倍子蜜、洋槐蜜。 精确称取 待测 蜂蜜 10g 加入 到 50mL 蒸馏水 倍比稀释至 0.2g/mL 的 浓度。冰箱保存备用。 2.1.3 主要 仪器、器皿及用品 灭菌锅 LMQ.J3870C 北京市永光明仪器厂 电子天平 XY200JC 常州

18、市幸运电子设备有限公司 电磁炉 DF-ES012 型 深圳市联创实业有限公司 生化培养箱 SPL-250 天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司 恒温培养振荡器 ZHWY-C2102 上海智城分析仪器制造有限公司 冰箱（ 14 教 311 试验 室提供） 无菌操作台 （ 14 教 311 试验室提供） 培养皿（直径 90 mm）、 烧杯（ 50mL）、移液管（ 1mL）、三角瓶（ 250 mL）、试管（ 10mL）、 打孔器（孔径 6 mm）、 牛津杯（内径 6 mm）、 新华 3 号滤纸、 涂5 布棒、酒精灯、马克笔、接种环、试管架 、 pH 试纸 。 2.1.4 培养基 液体培养基：蛋白胨 10

19、g/L，酵母粉 5 g/L， NaCl 10 g/L， 校正 pH 至 7.8 左右 ，121 灭菌 20min。 平板培养基：蛋白胨 10 g/L，酵母粉 5 g/L， NaCl 10 g/L，琼脂粉 20 g/L， 。将琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水中，加入 15%氢氧化钠溶液约 2mL，校正 pH 至 7.8 左右，加入琼脂，加热煮沸，使琼脂融化， 分装于三角瓶中， 121 灭菌 20min。 2.2 方法 2.2.1 菌种的活化及菌液的制备 分别挑取供试菌的 单菌落接种至 100 mL 液体培养基， 分别 分 装于三角瓶中， 37 、200 r/min 摇床培养过夜，菌液备用。 将菌液

20、按照十倍 进行梯度稀释， 将三种供试菌分为三个组， 每 组 取无菌试管 5 支 , 每支加 液体培养基 9.0 mL, 第 1 管加入 活化好的供试菌菌液 1.0 mL,混合后吸取 1.0 mL 加入第 2 管 , 同法稀释至第 5 管 。 2.2.2 试验平板的制备 涂布平板法：先往已灭菌的平板中倾注 20mL 左右平板培养基，水平静置凝固，接种 0.1mL 菌液，涂布均匀后备用。 预加菌液倾注平板法：往已冷却至 50 左右的平板培养基中注入 1mL 的菌液，混合均匀，倾注平板 20mL/平 板 ，水平静置凝固后备用。 2.2.3 抑菌 试验 K-B法：圆滤纸片经灭菌后烘干，浸泡于浓度为 0

21、.2g/mL的 待测蜂蜜 液中 0.5h，然后置于 接种有供试菌的 试验平板中， 置 35 温箱培养 16 18h，观察抑菌效果。 牛津杯法：将已灭菌的牛津杯置于 接种有供试菌的 试验平板中 ,往杯中注入 0.1mL浓度为 0.2g/mL的 待测 蜂蜜药液 ,置 35 温箱培养 16 18h，观察抑菌效果。 打孔法：用已灭菌的打孔器 在 接种有供试菌的 试验平板上打孔 ,小心挑去培养基小块以做成圆孔，往孔中注入 0.1mL浓度为 0.2g/mL的 待测 蜂蜜药液 ,置 35 温箱培养 1618h，观察抑菌效果。 2.3 试 验 方案 2.3.1 蜂蜜蜜源对蜂蜜抑菌活性的影响研究 将金黄色葡萄球

22、菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌三种菌的五个浓度梯度的菌体稀释6 液接种到 直径为 9cm的无菌培养皿中，同样浓度的同种供试菌各接种 4个试验平板，分为四组试验平板，暂用涂布平板法制作试验平板。待琼脂凝固后，用 k-B法进行抑菌试验（所有操作均在无菌工作台上进行） ， 4组试验平板分别用 荆条花蜂蜜、长白山椴树蜜、五倍子蜂蜜、洋槐蜂蜜抑菌 。通过比较培养皿中有无 抑菌现象出现 ，获得对供试菌有抑菌活性的蜂蜜品种。 2.3.2 试验平板制作方法的比较研究 将 金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌三种菌 的 五个浓度梯度的 菌体稀释液 接种到 直径为 9cm的 无菌培养皿中 ， 同样浓度的同种供试菌各

23、接种 2个试验平板，同样浓度的同种供试菌的试验平板用同一种方法制作， 共两种方法 ： 分别为预加菌液倾注平板法和涂布平板法。 待琼脂凝固后， 用 k-B法进行抑菌 试验 ， 所有操作均在 无菌 工作台上进行 。 通过比 较培养皿中细菌生长、分布情况，获得最适试验平板制作方法。 2.3.3 试验最适菌及其最适浓度研究 因为当抑菌剂含量一定时，抑菌圈的大小跟 菌种类及其 菌体浓度有很大关系，如果 该菌适应该抑菌剂所造成的环境，或者说如果该菌 菌 体浓度过大，会拮抗抑菌剂的作用，导致抑菌圈偏小，不易观察。 因此，研究 试验平板中的抑菌圈大小 ，以确定 最适合的活菌浓度 做蜂蜜的抑菌 试验 ，更利于抑

24、菌效果的观察 。 用上一步骤所得到的 试验 结果 制作试验平板， 将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌三种菌的五个浓度梯度的菌体稀释液接种到 直径为 9cm的无菌培 养皿中，同样浓度的同种供试菌各接种 3个试验平板， 待琼脂凝固后， 用 k-B法进行抑菌 试验 ，三个试验平板中至少两个出现抑菌现象，则证明蜂蜜对该浓度的该菌有抑菌效果 。通过比较 各个 培养皿中 的 抑菌 效果 ，细菌生长、分布情况，获得三种供试菌 5种浓度中，蜂蜜抑菌 试验 最适菌及其最适浓度。 2.3.4 蜂蜜抑菌活性检测方法比较 根据上述两个步骤试验结果，将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌三种菌的五个浓度梯度的菌

25、体稀释液接种到 直径为 9cm的无菌培养皿中， 将上述步骤所得出的 最佳菌液浓度的最适菌共接种 9个试验平板，待琼脂凝固后 ， 分别 采 用 K-B法、牛津杯法、打孔法三种不同的抑菌效果检测方法 进行抑菌 试验 ，每种方法作 3个平行样本，分别比较它们的优缺点，以期获得最佳 的 蜂蜜抑菌活性检测方法。 所有操作均在无菌工作台上进行 ， 通过比较培养皿中抑菌 效果 及其变化趋势，细菌生长、分布情况，获得最佳蜂蜜抑菌活性检测方法。 3 结果与分析 7 3.1 蜂蜜蜜源对蜂蜜抑菌活性的影响 蜂蜜蜜源对蜂蜜抑菌活性的影响结果如表 1 所示： 表 1 蜂蜜蜜源对蜂蜜抑菌活性的 影响 Tab. 1 Eff

26、ect of honey source on antibacterial activity of honey 荆条花蜜 五倍子蜜 椴树蜜 洋槐蜜 抑菌 现象 无 无 无 有 如表 1 所示： 试验时，荆条花蜜，五倍子蜜，椴树蜜在接种有供试菌的试验平板上均没有抑菌 现象 出现，即无抑菌效果，说明这些蜂蜜对这些供试菌 均 没有抑菌活性，而加有洋槐蜜的试验平板上有抑菌 现象 的出现，说明洋槐蜜对这些供试菌有抑菌活性。根据 Allen对新西兰 26 种蜜源的 345 个样品的研究结果可知 :不同蜜源的蜂蜜抑菌活性相差很大 13，这是因为蜂蜜中目前已经得到确认的主要抗菌活性成分有过氧化氢。蜂蜜中存在过氧

27、化氢 酶 ( Catalase)能分解过氧化氢 ,对过氧化氢的抗菌作用起一定的抑制作用，过氧化 氢酶含量越高，蜂蜜中过氧化氢的含量就越低，蜂蜜的抑菌效果就越差，而且过氧化氢酶主要来自花粉 ,极少部分来自花蜜。蜂蜜中还有很多非过氧化氢类物质具有很强的抑菌活性，它们主要包括黄酮类化合物、萜类、苯酚类以及有机酸中的苯甲酸和脱落酸等。蜂蜜中黄酮类化合物因蜜源植物不同而种类不同 ,因此蜜源植物不同的蜂蜜抑菌活性也不同 14。根据以上的结果与分析，后续试验均采用抑菌活性好的洋槐蜜进行 。 3.2 试验平板制作方法比较 试验平板制作方 法比较结果如下图 1 和下表 2 所示： (a)预加菌液倾注平板法 (b)涂布平板法 (a)Preloading bacteria liquid poured-plate method (b)Spread plate method 图 1 试验平板制备方法比较结果 Fig. 1 Result on comparison of manufacture method of test plate