辐照秸秆中毛霉菌的筛选及生产性能的分析——毕业论文.doc

1、 1 湖 南 农 业 大 学 全日制普通本科生毕业论文 辐照秸秆中毛霉菌的筛选及生产性能的分析 SCREENING OF MUCOR BACTERIUM IN IRRADIATED STRAW AND ANALYSIS OF ITS PRODUCTION PERFORMANCE 学生姓名 ： 学 号： 年级专业及班级： 食品质量与安全 指导老师及职称： 学 院： 食品科学技术学院 湖南 长沙 提交日期： 年 月2 目 录 摘要 . 1 关键词 . 1 1 前言 . 2 1.1 概述 . 2 1.2 国内外研究 . 2 1.3 研究目的与研究意义 . 3 2 材料与方法 . 4 2.1 试验材料

2、与试剂的配置 . 4 2.2 仪器设备 . 5 2.3 菌种扩大培养及腊八豆制作工艺 . 5 2.3.1 毛霉菌株的扩大培养 . 5 2.3.2 腊八豆的工艺流程 . 6 2.4 试验测定方法 . 6 2.4.1 样品 的分离筛选 -稀释平板法 . 6 2.4.2 毛霉菌株的蛋白酶测定方法 . 7 2.4.2 腊八豆不同时期总酸与氨基酸态氮的测定方法 . 8 3 结果与分析 . 8 3.1 样品分离筛选的结果 . 8 3.2 四株毛霉菌株 （ G0、 G1、 G2、 G3） 蛋白酶活力测定结果 . 9 3.3 腊八豆不同时期总酸与氨基酸态氮测定结果 . 10 4 结论 . 11 参考文献 .

3、11 致 谢 . 12 1 辐照秸秆中毛霉菌的筛选及生产性能的分析 摘 要 ： 以农科院提供的经过 10KGy、 20KGy、 30KGy 辐照后的秸秆进行分离纯化，获得不同辐照的毛霉菌株，通过对 3 个辐照剂量的毛霉菌进行蛋白酶活力测定，结 果显示，经过 30KGy 辐照后的秸秆中的毛霉菌株酶活力最高，将筛选出的最高酶活力的毛霉菌株和对照组的毛霉菌株两者同时进行腊八豆的制作，通过对两者降解蛋白质能力大小的对比，得出 30KGy 中氨基酸态氮的含量为 0.92g/100g 与对照样中氨基酸态氮含量为 0.65g/100g 相比高出 1.4 倍，此结果可为后续发酵豆制品制作且对优良菌株的提高获取

4、提供依据。 关键词 ： 毛霉菌 ; 分离筛选 ; 酶活力 ; 腊八豆 Screening of Mucor Bacterium in Irradiated Straw and Analysis of Its Production Performance Abstract : The straws irradiated by 10KGy, 20KGy and 30KGy provided by the Chinese Academy of Agricultural Sciences were separated and purified to obtain different irradiate

5、d Mucor species. The protease activity of three irradiated doses of Mucor . The highest enzyme activity of the mucormycin in the irradiated straw was 30KGy. The mucor fungus strain with the highest enzyme activity and the mucormycin species of the control were screened at the same time for the produ

6、ction of Laba Bean. Comparing the ability to degrade proteins, it is found that the content of amino acid nitrogen in 30KGy is 1.4 times times higher than that of amino ac id in 0.92g/100g and Control sample 0.65g/100g. This result can be used for the subsequent production of fermented soybean produ

7、cts and it is excellent. The basis for the improvement of strains will be provided. Keywords: Mucor fungus; isolation and screening; enzyme activity; Laba Bean 2 2 1 前言 1.1 概述 微生物广泛分布于我们生活坏境中，它们与我们生活息息相关，毛霉更是在我们生活食用中广泛使用和存在，例如：腐乳、腊八豆、豆豉等食品的制作都使用毛霉菌进行菌株发酵，同时在果实贮藏时间过长也可能导致毛霉生长从而导致果实腐烂。毛霉又别称为黑霉、长毛霉。毛霉

8、1属于真菌中的接合菌亚门接合菌纲毛霉目毛霉科，可导致植物产后病害，其繁殖方式多体现为孢囊孢子和接合孢子。与根霉相对毛霉不存在假根，不存在匐伏枝，孢囊梗直立生长。毛霉菌菌丝与白地霉菌丝相比更长，且其菌丝体上可生长孢子囊。孢子囊可分生出大 量球形、椭圆形、光滑的孢子。毛霉菌丝的颜色会随着时间的延长，由于生成大量成熟的孢子囊而产生变化，其颜色由最初的白色转变为灰白色最终转变为黑色。同时毛霉菌丝随时间的加长生长速度更快延长速度也更快。 毛霉内含相当丰富的酶系，由于毛霉中的蛋白酶是自身产生的自然复合型酶系，即可产生酸、中和碱性三种特性的蛋白酶。本文主要是对毛霉中蛋白酶活力的测定从而获得最高酶活力的毛霉菌

9、株来进行运用和验证，在蛋白酶特性的研究探索上 2-4，多方面文献表明毛霉在麸皮制曲培养后，用水浸提之后可以获得相对高活力的复合蛋白酶，且在最适合的 温度与 pH 下大豆分解蛋白水解的催化能力更强，酶解产物的味道也相对略咸，但不存在苦涩味并余味略鲜美。 1.2 国内外研究 目前，国内在对毛霉的研究主要在于对优良菌株的选育，通过选取优良的菌株来制作产品，获得比原产品更高效更优良的食品。根据多方面的文献书籍的阅读，本文中对蛋白酶活力的测定采用的方法为福林酚法，此法是对蛋白酶活力定性分析的一种方法，采用此方法的原因主要是因为酪蛋白在特定的 T 和 pH下，可被水解为酪氨酸，此时的酪氨酸是富含了酚基的酪

10、氨酸，正因为酚基的存在，福林 -酚试剂在此碱性条件下被还原产生蓝色的钨蓝和 钼蓝，其颜色的深浅在特定的浓度范围随着酚类化合物的含量的多少而产生相应的变化。其测定波长是在680nm下，对样品以及空白样吸光度的测定，采用此方法在对蛋白酶活性的分析上较高的精密性，较好的重复性，且在样品大量存在的情况下用该方法分析，对单个样品的时间耗费也相对较短 5-7。 在对毛霉菌的分离筛选中，庞宗文 8的研究验证了毛霉菌株 HN201 在进行蛋白酶活力、游离氨基酸、活性肽活性三个指标的测定时想要获得此菌株总蛋白3 3 酶活力最高的充要条件是在 28发酵培养 4d，并且此时的游离氨基酸的含量随着时间的延长而增加。

11、而在陈嵘 9的探究中阐述了在初筛中的 M-339、 M-513 和M-808 三种菌株毛霉菌与另外 23 株毛霉菌相比透明圈更大，生长速度也更快，根据透明圈以及生长速度可以推断出其酶活力的大小也相对较高。 在对毛霉蛋白酶提取的方法中，郭林海 10的研究验证了雅致放射毛霉在通过正交实验后，采取硫酸铵分级沉淀法是对其蛋白酶最适提取的方法，主要原因是金属离子钙、镁、铁离子对蛋白酶有较高的激活作用，但银离子对其有抑制作用。同时，刘莹莹 11的研究表明雅致发射毛霉在 4050时蛋白酶的热稳定性也较强，且 pH 在中性和弱碱性 时蛋白酶能保持稳定状态，活力也较稳定。 在毛霉的产蛋白酶条件的选取上，邓晓婷

12、12的研究验证了毛霉菌菌株 M2产蛋白酶最适条件为：培养温度为 28，初始 pH 为 5.0。刘芳 13的研究在对优良菌株 LCM-毛霉 M3 的探究中验证了其产酶最适条件为：培养温度 28，初始pH7.0，且此时获得的蛋白酶活力有明显的提高。而程昌泽 14的研究表明对16SDNA 的 ITS 系列可以判断生产菌株的衰退情况。由此不难看出，其条件的优化上主要是在温度和 pH 值上，说明温度和 pH 对毛霉产蛋白酶的有一定的影响。然而罗晓妙 15的研究 是对毛霉菌菌株胞外蛋白酶在耐温性进行探究，从而发现不同的菌株的蛋白酶在耐温性上各有不同，以至于对 NaCl浓度也存在相应的差异。在其他因素上 p

13、H、高压电场、水分活度的不同对蛋白酶活力也存在一定的影响，并且高压电场在一定范围对其有激活作用或抑制作用 16-17。 1.3 研究目的与研究意义 由于秸秆经过辐照后，其本身的酶解效果发生相应的改变的原因 18-19。对辐照剂量为 10KGy、 20KGy、 30KGy 秸秆进行毛霉菌的筛选，研究不同辐照剂量对毛霉菌中蛋白酶活力的影响，为后续发酵豆制品制作且对优良菌株的提高获 取提供依据。 通过对以上知识的了解和拓展，本文通过制作腊八豆来验证样品中最高酶活力的毛霉菌株为优势菌株。腊八豆 20-22是我国湖南省小吃之一，其名字的由来是腊八豆多于每年的立冬之后开始发酵，并至腊月八日后才可食用，即故

14、称为腊八豆。腊八豆接种毛霉菌株经过前、后发酵，其自身产生相当丰富的营养物质，营养价值也得到提升。本文通过对制作腊八豆过程中氨基酸态氮含量变化的测定从而来证实样品中最高蛋白酶活力的毛霉菌株。 4 4 2 材料与方法 2.1 试验材料与试剂的配置 材料 :农科院提供的经过 10KGy、 20KGy、 30KGy 辐照剂量辐照的秸秆，对照样为学校实验室提供的毛霉菌株。 2.1.1 样品分离筛选培养基的配置 培养基 :孟加拉红培养基 准确称取蛋白胨 10.0g，葡萄糖 20.0g，磷酸二氢钾 2.0g，无水硫酸镁 1.0g，琼脂 40.0g， 1%孟加拉红适量，氯霉素一支，蒸馏水 2000mL。将上述

15、各成分加入蒸馏水中，加热充分溶解，补足蒸馏水 2000mL，分装至 500mL 的锥形瓶中，置于高压灭菌锅中，在 121，灭菌 20min。倒平板前，使用 6mL 生理盐水溶解氯霉素加入培养基中。 2.1.2 毛霉菌蛋白酶测定试剂的配置 福林试剂 实验室 提供 pH7.2 磷酸盐缓冲盐 称取二水磷酸二氢钾 3.12g，定容至 100mL，此时溶液为 0.2mol（ A 液）。再称取十二水磷酸氢二钠 7.163g，定容至 100ml，此时溶液为 0.2mol（ B 液）。取 A 液 28mL 和 B 液 72mL，用蒸馏稀释，定容至 1000mL，即制成 0.1mol pH7.2的磷酸盐缓冲液。

16、 0.4mol/L 碳酸钠溶液 称取无水碳酸钠 10.6g，加入蒸馏水稀释定容至 250mL。 0.4mol/L 三氯乙酸 称取三氯乙酸 16.35g，加入蒸馏水稀释定容至 250mL。 0.1mol/L 氢氧化钠 称取 5g 氢氧化钠，加入蒸馏水稀释定容至 250mL。 0.2mol/L 盐酸 用 10mL 吸管吸取 16.7mL 浓盐酸，加入蒸馏水稀释定容至 1000mL。 1mol/L 盐酸 用 1mL 吸管吸取 1mL 浓盐酸，加入蒸馏水稀释至 12mL。 1%酪蛋白溶液 精确称取干酪素 1g，加入 0.1mol/L 氢氧化钠 10mL，在水浴中加热使之充分溶解（由于干酪素较难溶解可使

17、用小火加热煮沸），然后再使用 pH7.2 磷酸盐5 5 缓冲液定容至 100mL 配置。配置后应及时使用或冰箱保藏，因为其极容易发生细菌的增值从而导致溶液变质。 100g/mL 酪氨酸标准 溶液 准确称取恒重的酪氨酸 0.1000g，慢慢加入 6mL1mol/L 盐酸使其溶解，再使用 0.2mol/L 盐酸定容至 100mL，即配置成 100g/mL酪氨酸标准溶液。配置后应及时使用或冰箱保藏，因为其极容易发生细菌的增值从而导致溶液变质。 2.1.3 腊八豆总酸和氨基酸态氮测定试剂的配置 (1)氢氧化钠溶液氢氧化钠标准滴定溶液 c（ NaOH） =0.05mol/L 称取 110g 氢氧化钠于

18、300mL 的锥形瓶中，加入 100mL 的蒸馏水，振荡摇晃使其充分溶解为饱和溶液，放置冷却，将冷却后的氢氧化钠溶液置于玻璃瓶中，用橡胶塞 塞住瓶口，密封，取氢氧化钠溶液 2.7mL,加入煮沸后冷却过后的蒸馏水稀释定容到 1000mL，摇匀。 (2)氢氧化钠溶液氢氧化钠标准滴定溶液 c（ NaOH） =0.1mol/L 称取 120g 氢氧化钠于 300mL 的锥形瓶中，加入 100mL 的蒸馏水，振荡摇晃使其充分溶解为饱和溶液，放置冷却，将冷却后的氢氧化钠溶液置于玻璃瓶中，用橡胶塞塞住瓶口，密封，取氢氧化钠溶液 5.6mL，加入煮沸后冷却过后的蒸馏水稀释定容到 1000mL，摇匀。 (3)酚

19、酞指示剂 准确称取酚酞 1g，溶于 95%的乙醇中，用 95%乙醇稀释定容到 100mL。再装入 玻璃瓶中备用。 (4)氢氧化钠标准滴定溶液的标定 精准称取约 0.36g 干燥恒重的基准物邻苯二甲酸氢钾，加入 80mL 煮沸过并冷却的蒸馏水，加入其中，使其溶解更加充分，加入 2-3 滴酚酞指示剂，采用氢氧化钠溶液进行滴定，当溶液滴定至呈微红色且 30s 内不褪色时，记下所消耗使用的氢氧化钠溶液的体积，同时做空白试验。 2.2 仪器设备 超净工作台、高压灭菌锅、培养箱、显微镜、分光光度计、干燥箱、电子天平、分析天平、玻璃仪器、磁力搅拌器、碱式滴定管等 2.3 菌种扩大培养及腊八豆制作工艺 2.3

20、.1 毛霉菌株的扩大培养 利用麸皮对毛 霉菌进行扩大培养，采取麸皮与水 1:1 的比例，将麸皮加入6 6 300mL 锥形瓶中盖满底部，配置两瓶并用棉塞牛皮纸包扎，置于高压灭菌锅中121，灭菌 30min。将两瓶灭菌完成的麸皮在超净工作台中分别接入目的毛霉菌株和对照毛霉菌株，接种完成后置于 28培养箱，培养 2d。 2.3.2 腊八豆的制作工艺 黄豆预处理浸泡熟化冷处理接种前发酵后发酵成品 2.3.3 工艺操作 预处理 将购买的黄豆进行筛选，除去干瘪，不完整，色泽不亮丽的颗粒，挑选完成后对其进行清洗。 浸泡 将洗净的黄豆置于盆中，加入清水浸泡一整夜，第 二天备用。 熟化 将前一天浸泡的黄豆过滤

21、除去多余的水分，用清水清洗干净后，置于高压灭菌锅中 121，灭菌 30min，使之黄豆的颗粒熟化均匀，并且使其颗粒完整不破损，色泽也相对亮丽，并且散发宜人的香味。 冷处理 将高压灭菌完成的黄豆放置于通风处使其充分冷却。 接种 将冷却后的黄豆分别分装于 500mL 锥形瓶中并铺满底部，用灭菌后的无菌勺子挑取最高酶活力的毛霉菌株和未辐照的毛霉菌株分别接入对应的锥形瓶中，每个菌株接两瓶，制成平行样。 前发酵 将接种好装有黄豆的 4 瓶 500mL 锥形瓶置于培养箱 25，培养 2-3d。 后发酵 将前发酵好的黄豆取出，称重，分别加入 6%的盐， 0.5%的花椒， 1%姜，再加入适量古曲白酒，将其混合

22、均匀，采用封口机封口密封，每个样品处理重复 2次，将密封好的黄豆置于培养箱 25，培养 7d。 2.3 试验测定方法 2.3.1 样品的分离筛选 -稀释平板法 1)样品的处理 将辐照的秸秆样品称取 25.0g，加入装有 225mL 无菌生理盐水并放入适量玻7 7 璃珠的锥形瓶中，振荡摇匀约 15min，使秸秆与水充分混合，并使之细胞分散。使用一支 1mL 无菌吸管从稀释样品中吸取 1mL 加入盛有 9mL 无菌生理盐水的试管中，振荡使之混合均匀，采用同样的操作制成一系列不同稀释度的样品溶液。 2)样品的培养 选取 10-5、 10-6 和 10-7 这 3 个稀释度分别精确吸取 1mL 稀释度

23、菌液加入到空无菌平皿中，同一稀释度重复做 3 个平皿。将孟加拉红培养基倒入添加了稀释菌液的平皿中，每个平皿中加入 15-20mL 的孟加拉红培养基 ，轻轻旋转使培养基与稀释液充分混匀，置于桌面上，使之凝固。凝固后倒置放入培养箱 28培养2-3d。 3)菌株的筛选 挑取平皿上的菌落进行显微镜镜检，观察菌落个体形态筛选出纯种毛霉菌，将挑选出的 3 个不同辐照剂量的毛霉菌株进行菌株保藏。 2.4.2 毛霉菌株的蛋白酶测定方法 采用福林酚法测定，以酪蛋白溶液为标准作标准曲线 a.以酪蛋白为反应底物，配置不同浓度的酪氨酸溶液（ 1050g/mL，见表 1，采用福林酚法定量检测 680nm的吸光度，并以蒸

24、馏水作为对照。 b.分别取酪氨酸标准溶液各 1.00mL,各加 0.4mol/L 碳酸 钠溶液 5.00mL，福林试剂使用液 1mL，置于 40水浴中保温 20min 显色取出，用分光光度计进行吸光度的测定，将波长设置在 680nm、使用 10mm 的比色皿，再以不含酪氨酸的 0管为空白，分别测定其吸光度。以吸光度 A 为纵坐标，酪氨酸的浓度 c 为横坐标，绘制标准曲线。 表 1 不同浓度的酪氨酸溶液配制 Table 1 Different concentrations of tyrosine solution preparation 管号 酪氨酸标准溶液浓度/(g/mL) 移取 100g/m

25、L 酪氨酸标准溶液体积 蒸馏水体积 /mL 0 0 0 10 1 10 1 9 2 20 2 8 3 30 3 7 4 40 4 6 5 50 5 5 8 8 c.测定：取 1mL 样品加入已预先 40保温的装有 1mL 1酪蛋白溶液（ pH7.2的磷酸缓冲液配制 )的离心管中，于 40水浴保温 10min，迅速加入 2mL 0.4mol/L三氯乙酸终止反应，继续置于水浴中保温 20min，离心取上清液 1mL 置于试管中，加入 5mL 0.4mol/L 碳酸钠溶液及 1mL 福林溶液，混匀后于 40保温 20min，测定其在 680nm 处的吸光度。酶活力 定义：再 pH 值 6.8 的测定

26、条件下，每 1min水解酪蛋白释放 1g酪氨酸的酶量为 1 个蛋白酶活力单位（ U）。 酶活力 （ U/mL） = OD680nmNK )10/4(2.4.3 腊八豆不同时期总酸与氨基酸态氮的测定方法 采用 GB5009.235-2016 食品安全国家标准 食品中氨基酸态氮的测定 -甲醛滴定法 采用 GB/T12456-2008 食品安全国家标准 食品中总酸的测定方法 -pH 电位法 分别对不同发酵时间的黄豆进行氨基酸态氮的测定，取黄 豆置于研钵中研磨10min，使黄豆充分破碎成匀浆，称取研磨后的黄豆样品 5.0g 置于 100mL 烧杯中，加入 100mL 70左右的蒸馏水多次洗涤加入至 1

27、00mL 的容量瓶中，定容，过滤出样液，用 10mL 吸管吸取 10mL 样液，置于 250mL 的烧杯中，加入 60mL的蒸馏水，将磁力搅拌器的搅拌子放入烧杯中，开启磁力搅拌器，并将酸度计放入烧杯中，观察 pH 值的变化，使用氢氧化钠标准溶液对其进行滴定，滴定至 pH为 8.2 时，记下此时所消耗的氢氧化钠标准溶液的毫升数，计算总酸含量，再用10mL 吸管吸取 10mL 甲醛溶液加入烧杯中 ，用氢氧化钠标准溶液对其进行滴定，滴定至溶液 pH 为 9.2，记下此时所消耗的氢氧化钠标准溶液的毫升数，对数据进行统计计算。并对不同发酵时间的黄豆中总酸的含量与氨基酸态氮的含量进行分析。 3 结果与分析 3.1 样品分离筛选的结果 对 10KGy、 20KGy、 30KGy辐照后的秸秆采取稀释平板法， 28 2-3d 培养后，在超净工作台内，使用接种环挑取各辐照剂量的毛霉菌落于载玻片上，滴加1-2 滴棉兰染液，盖上盖玻片，吸取多余的染液，置于显微镜下观察，从而通过镜检的方式来对分离的毛霉菌进行个体形态分析（见图 1，图 2，表 2）。