酶法辅助提取小米多酚的工艺研究.DOC

1、酶法辅助提取小米多酚的工艺研究 魏春红 1 何丽娜 1 丁闻浩 1 鹿保鑫 1 曹龙奎 1， 2* 1黑龙江八一农垦大学食品学院 黑龙江 大庆 163319； 2 国家杂粮工程技术研究中心 黑龙江 大庆 163319 摘 要：以武安小米为原料，研究 以 木瓜蛋白酶和 -淀粉酶复合辅助提取多酚的最佳工艺参数，通过单因素试验和响应面 优化试验 分析液料比、酶用量、酶解时间、酶解温度对小米多酚提取率的影响，结果表明：液料比为 14： 1， 双酶添加量为 0.9%， 酶解时间为 2 h，酶解温度为 40 。这种处理条件下，小米多酚得率可达 4.83 mg/g， 所建立的模型精确，能够准确预测多酚的提取

2、率， 除此之外 ， DPPH 自由基消除能力 为 83.42%，抗氧化 能为为3.67%， 展现了优异的抗氧化能力。 关键词：小米；多酚；酶解法；响应面法 中图分类号： TS213 文献标识码： A 文章编号： 1003-0174（ ） Enzymatic assisted extraction of polyphenolics from Millet Abstract: The Millet of Wu An was chosen as raw material， The optimum conditions were carefully studied in the process of

3、assisted extraction of polyphenols from mixture of Papain and alpha-amylase. The impact of Liquid to material ratio， enzyme concentration， extraction time，extraction temperature on polyphenols extraction rate was analyzed by single factor and orthogonal experiments， which was used to optimize the de

4、sign of polyphenols extraction process conditions. The results showed that Liquid to material ratio 14:1， Papain and alpha-amylase 0.9%，extraction time 2h， extraction temperature 40 . The polyphenols extracted under optimum conditions was 4.81mg/g， So the model was accurate， which can optimize the e

5、xtraction process parameters of garlic polyphenols， In addition， the DPPH free radical elimination ability is 83.42%， and the oxidation resistance energy is 3.67%， which showed excellent antioxidant properties. Key words: Millet; polyphenols; enzyme-assisted; response surface 小米 （ Setaria italica） ，

6、 亦可称作谷子，是一类小种可食用禾本科植物的总称， 主要种植于干燥带边缘、温带、亚热带和热带地区，是全球第六大重要谷物 1。 在我国主 要食用的杂粮中，小米是非常重要的一种，产于东北、华北地区。小米富含蛋白质、氨基酸、维生素及优质的不饱和脂肪酸，具有防止动脉硬化、减少心脑血管疾病、降血压和抗癌等重要作用2， 这些功能主要是由许多微量营养元素和小米中的植物化学物质，包括抗性淀粉，抗氧化剂如酚酸和类黄酮，以及激素活性化合物，如木脂素和植物甾醇 3， 相比于其它的杂粮物质，小米中多酚的含量与种类更加的丰富 4。 近年来，多酚类物质成为国内外食品界研究的重点之一，大量的试验与研究表明多酚类物质具有独特

7、的生理功效与药用价值，市场前景广阔。其可以广 泛的应用于食品的抗氧化、基金 项目 ：中央引导地方科技发展专项资金项目，“ 大豆、杂粮等 品种推广及加工技术落地转化 ” （ 编号： ZY16C07） 作者简介：魏春红 ，女， 1982 年出生 ， 硕士 ，农产品精深加工 通讯作者：曹龙奎 ， 男 ， 1965 年出生 ， 教授 ，农产品加工 防腐与澄清等方面；在农业生产中，可与多种微量元素螯合物处理苹果树和银杏树，使苹果增产 19.8%-25.4%，银杏叶增产 25.5%5；而在医药领域，还可作为抗菌、抗病毒、抗癌的天然药物 6。尽管多酚有诸多作用，但国内多酚的提取率相对较低 7， 而且提取方法

8、的差异对提取率的影响非常大。 为了有效获取小米中的多酚，研究者们已通过多种途径提取。最常用的方法是溶剂提取法 8，此法处理时间长、提取效率低，虽然通过一些辅助的提取方法如微波 9、超声波 10等可以适当的提高多酚的得率 11， 12，但始终无法避免大量有机试剂如乙醇的使用，造成了不可避免的环境污染和能源浪费。 近几年，一些研究人员利用酶法来辅助多酚的提取，取得了理想的效果 13-15，利用木瓜蛋白酶 酶解核桃粕蛋白产物 16， -淀粉酶水解制备银杏抗性淀粉 17， 与其他方法相比，酶处理方法具有快速、高效、温和、专一性强等诸 多优点，并且在成本和使用上更加简便，对设备和工艺的要求也较少 18。

9、但是，目前为止，利用酶法提取小米多酚还未见报道。 本研究利用小米作为原料，采取单因素与响应面为研究手段，将酶法引入到小米中多酚的提取工 艺中，以其提高小米中多酚的得率，为小米资源的进一步开发利用提供理论的基础。 1材料与方法 1.1原料 武安小米： 产于 河北省 邯郸市 武安市 ，蛋白质含量约为 9.2-14.3%， 粗脂肪含量 3.0-4.6%。 没食子酸： 上海一研生物科技有限公司 ； 福林酚：北京华迈科生物技术有限责任公司；木瓜蛋白酶 （ 6000 U/g） ：滕州市天水生物科技有限公司； -淀粉酶 （ 40000 U/g） ：邢台万达生物工程有限公司； DPPH、 TPTZ，美国 Si

10、gma 公司。 1.2主要仪器设备 WKF-20BZ高速万能粉碎机： 北京格瑞 德曼仪器设备有限公司 ； 76-1B恒温震荡水浴锅：上海启前电子科技有限公司； SP-752/752PC 紫外可见分光光度计： 上海光谱仪器有限公司 ；FA-G 系列感应窗型分析天平 ： 常州万泰天平仪器有限公司 ； CTK120C 离心机： 湘仪离心机仪器有限公司 。 1.3试验方法 1.3.1酶法辅助提取工艺流程及操作要点 小米 40 烘箱处理 5h 粉碎筛分 称取定量样品按 0.8%添加酶液 设定酶解条件 过滤 离心 上清液 定容 检测多酚含量。 将小米去杂、磨碎、过筛，准确称取一定量的小米粉，加入石油醚索式

11、抽提得到小米脱脂产物， 4 下储藏备用。精密称取一定质量脱脂小米粉放入锥形瓶中，调整其 pH至 5.0，随后加入 1%的木瓜蛋白酶与 -淀 粉酶，二者比例为 1:1（ w/w），分别调整不同的酶的添加量、酶解时间跟酶解温度，过滤，收集滤液，将滤液离心得到上清液，减压蒸馏得到浓缩液，取浓缩液 1 mL定容至 10 mL，测吸光度并计算多酚得率。 1.3.2多酚含量测定方法 1.3.2.1 总酚标准曲线绘制 精确称取没食子酸标准品 25 mg，去离子水溶解后定容于 250 mL 容量瓶中，得 0.1 mg/mL的对照品标准溶液。精密吸取对照样品溶液 0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0.5

12、mL于 10mL容量瓶中，再加入 1 mL Folin-Cio-calteau 试剂，摇匀后加入 2 mL 15%Na2CO3溶液定容 10mL，常温下让其反应 2h，在 760 nm 处测定其吸光值。得回归方程为： y=12.861x+0.0829，R2=0.9990。 Y为吸光度值， X 为没食子酸含量（ mg）。 1.3.2.2 总多酚含量的测定 以 Foiri-Ciocalteu 法 19测定总多酚含量，以没食子酸作为标准物。 用移液枪移取 1mL待测样品，添加上述 Foiri-Ciocalteu 溶液，随后，添加 2 mL 15%的Na2CO3溶液，将其充分摇匀后，常温放置 2 h，

13、随后在 760 nm 处测定 其吸光值。 1.3.3抗氧化性测定 1.3.3.1 DPPH自由基消除能力测定 取 0.5 mL样品，加入 2.5 mL含 100 mol/L DPPH的乙醇溶液，混匀，室温放置 30 min后， 5000 r/min 离心 5 min，在 517 nm 处测定吸光值（ A 样 ），以 5000 r/min 离心 5 min 过后的上清液调仪器零点；同时检测 2.5 mL含 100 mol/L DPPH 的乙醇溶液与 0.5 mL蒸馏水的吸光值（ A0）。对 DPPH自由基的清除率（ %） =（ A0-A 样 ） /A0100%。 1.3.3.2 FRAP 法测定

14、抗氧化能力 配制不同质量浓度的 FeSO4溶液 50 L，各加入 3.0 mL TPTZ 工作液， 37 水浴 30 min，测定 595 nm处的吸光度。以蒸馏水为空白样调零。以吸光度为纵坐标， FeSO4质量浓度为横坐标绘制标准曲线。取 1.0 mL样品，以蒸馏水定容到 10 mL，准确吸取稀释液 50 L，加入 3.0 mL TPTZ 工作液， 37 水浴 30 min，测定 595 nm处的吸光度。抗氧化能力用 FeSO4标准溶液的浓度来表示。 1.3.4单因素试验 为获得小米中的多酚含量，分别对液料比 10： 1、 12： 1、 14： 1、 16： 1、 18： 1（ v / w）

15、、双酶添加量为 0.3%、 0.6%、 0.9%、 1.2%、 1.5%，酶解时间 1、 1.5、 2、 2.5、 3 h，酶解温度20、 30、 40、 50、 60 做单因素试验， 以确定各因素的最佳水平。 1.3.5响应面优化工艺参数 为了确定最优酶法辅助提取小米多酚工艺条件，以单因素试验为基础，利用响应曲面法对其进行优化处理，即以液料比、 双酶添加量、 酶解时间、酶解温度为自变量， 多酚得率 为响应值，设计 4 因素 3 水平优化试验 。其试验因素水平表 1 所示。 表 1 Box-Behnken 试验因素水平表 水平 因素 A 液料比 / v /w B 双酶添加量 /% C 酶解时间

16、 /h D 酶解温度 / -1 12： 1 0.6 1.5 35 0 14： 1 0.9 2.0 40 1 16： 1 1.2 2.5 45 1.4 试验数据处理 所有数据通过三次测定后取得平均值，用 Origin9.1 做图， SPSS V 19.0 分析其显著性，响应面分析采用 Box-Behnken 模型。 2 结果与分析 2.1 单因素实验结果与分析 2.1.1液料比对小米多酚得率的影响 图 1 中，可以发现， 随着料液比的不断上 升，小米中的多酚得率呈现出先快速上升，后缓慢下降的趋势。在液料比为 14 1 时，其多酚的得率最高，为 4.80 mg/g。这是因为伴随着液料比的不断增加，

17、溶剂和小米之间的接触面增大，从而有利于小米多酚得溶出 20，但是，当液料比的比值过高时，由于酶与底物的接触会由于稀释过度而受限，酶的作用受到抑制，进而影响了多酚的提取率， 不仅如此，但是过大的料液比在实际的生产过程中不仅增加了水的消耗，并且增加后续的浓缩成本，对后续加工造成困难 因此 ，选择液料比为 14： 1做为最适宜液料比。 2.1.2双酶添加量对小米多酚得率的影 响 从图 1中可以发现，随着复合酶用量增加，多酚含量明显上升。这是因为淀粉酶在适宜的介质中可以水解小米中的淀粉，有助于与淀粉结合的部分多酚释放，这与吕俊丽21研究莜麦中多酚的提取的结果相一致， 但是，当双酶的添加量超过 0.9%

18、时，多酚的含量却呈现出下降的趋势。 这是 虽然适量 木瓜蛋白酶 可以通过破壁改变细胞壁的通透性，使得细胞壁破裂增加有效成分的溶出，提高多酚的提取率，但是多酚的分子可以与蛋白质和氨基酸发生很强的络合反应，而酶是具有催化活性 的蛋白质，当酶过量时就会与 多酚络合，最终影响 22， 而且当继续增加酶量， 酶与底物的接触面积过剩，会降低反应速率， 不仅总酚溶出会降低，而且会增加投入 ， 进而减少了溶液中可提取的多酚的含量。 2.1.2酶解时间对小米多酚得率的影响 从图 1 能发现，伴随着酶解时间的不断延长，小米多酚得率也不断的上升，在 2 h 时便达到了最大值，随着酶解时间的继续延长，其多酚得率趋于稳

19、定。这是由于随着酶解时间的不断变化，小米细胞壁与细胞间层的纤维素的隔层被有效的破坏了，多酚便可以更容易的从细胞内流出，但当达到适宜的时间后，其多酚类物质在细胞内外处于平衡的状态，更长的酶解时间对其作用影响不大，反而会由于更长时 间的酶解使得小米中的多酚产生不必要的损失 ， 甚至于发生氧化反应， 导致酚类的含量有所降低 23。因此，考虑到时间与生产成本等因素， 选择酶解时间 2 h 为宜。 2.1.3酶解温度对小米多酚得率的影响 图 1 中，在适宜的温度范围内，温度升高，小麦中多酚得率也有所增加，在 40 时其多酚的得率达到了最大值。这是因为：一方面木瓜蛋白酶与 -淀粉酶酶解活力随温度升高而增强

20、，使反应速率加快，另一方面，在加热过程中，淀粉本身可发生膨胀并释放直链淀粉，随着加热的进行，淀粉颗粒破裂， 使得多酚物质得以从笼形包含物中释放出来，因此 ，多酚得率随之增加 24。有研究表明，二者相比，酶解作用是促进小麦粉中多酚释放的主要原因 25。当温度进一步提高过程中，多酚得率反而降低。这是因为温度持续升高，导致酶活力减弱，稳定性降低，且高温还可能会破坏已提取出来的多酚结构 10，故选取 40 为最佳酶解温度。 10 :1 12 :1 14 :1 16 :1 18 :12. 53. 03. 54. 04. 55. 05. 5多酚得率(mg/g)液料比 (v /w)液料比0. 0 0. 3

21、0. 6 0. 9 1. 2 1. 5双酶添加量双酶添加量 (%)0. 5 1. 0 1. 5 2. 0 2. 5 3. 0 3. 5酶解时间酶解时间 (h )10 20 30 40 50 60 70酶解温度酶解温度 ( )图 1 液料比、 复合酶用量 、 酶解时间 、 酶解温度对 小米 多酚得率的影响 2.2响应面法对小米多酚提取工艺的优化 在单因素试验的基础上，选取 液料比、双酶添加量、酶解时间、酶解温度 为四个影 响因素，将响应 R 值确定为 多酚得率 ，其试验方案与设计见表 2。 表 2 试验方案及结果 试验号 A B C D R多酚得率 /mgg-1 1 0 0 0 0 4.82 2

22、 0 0 0 0 4.84 3 0 0 0 0 4.81 4 0 0 1 1 3.95 5 -1 0 0 1 3.36 6 1 1 0 0 3.55 7 -1 -1 0 0 3.14 8 0 0 1 -1 3.94 9 0 -1 0 -1 3.54 10 -1 0 1 0 3.37 11 0 -1 1 0 3.41 12 0 0 -1 -1 3.95 13 -1 1 0 0 3.09 14 0 0 0 0 4.72 15 0 0 -1 1 3.94 16 0 -1 0 1 3.79 17 0 0 0 0 4.85 18 0 -1 -1 0 3.56 19 1 0 0 1 3.38 20 0 1

23、 1 0 3.58 21 -1 0 0 -1 3.37 22 -1 0 -1 0 3.27 23 0 1 0 -1 3.78 24 1 0 0 -1 3.38 25 1 -1 0 0 3.08 26 0 1 0 1 3.47 27 1 0 -1 0 3.28 28 1 0 1 0 3.26 29 -1 0 1 0 3.16 通过统计分析软件 Design-Expert 进行数据分析，得到关于 R 的方程为： R=4.81+0.045A+0.043B-0.022C-5.833E-003D+0.13AB+0.022AC+2.500E-003AD+0.040BC-0.14BD+5.000E-003C

24、D-0.98A2-0.70B2-0.54C2-0.41D2 表 3 方差分析 方差来源 自由度 平方和 均方 F 值 PrF A 1 0.024 0.024 2.15 0.1648 B 1 0.023 0.023 1.99 0.1799 C 1 6.075E-003 6.075E-003 0.54 0.4757 D 1 4.083E-004 4.083E-004 0.036 0.8520 AB 1 0.068 0.068 5.98 0.0283 AC 1 2.025E-003 2.025E-003 0.18 0.6786 AD 1 2.500E-005 2.500E-005 2.211E-00

25、3 0.9632 BC 1 6.400E-003 6.400E-003 0.57 0.4643 BD 1 0.078 0.078 6.93 0.0197 CD 1 1.000E-004 1.000E-004 8.843E-003 0.9264 A2 1 6.24 6.24 551.62 B C D，即液料比 双酶添加量 酶解时间 酶解温度。 由回归系数的显著性检验可知，液料比与双酶添加量、双酶添加量与酶解温度的交互作用达到显著水平 ( P 0.05)。响应面越陡，各因素之间的两两交互作用越显著 。液料比在 13:1-15:1、 双酶添加量 0.8%-1%的范围内存在极值， 即两者之间存在较好的

26、交互作用。在液料比为 13:1-14:1 之间时，随着双酶添加量的增大，总多酚得率增加，在液料比为 14:1-15:1之间时，随着双酶添加量的增大，总多酚得率减少。双酶添加量在 0.8%-1.0%，酶解温度在39 -41 之间存在极值，在双酶添加量 0.8%-0.9%之间，随着酶解温度的增加，总多酚得率增加，在双酶添加量 0.9%-1.0%之间，随着酶解温度的增加，总多酚得率降低。 通过以上的模型可以得到的结果为：液料比为 14.05： 1、双酶添加量为 0.91%、酶解时间为 1.99h、 酶解温度为 39.94 ，所能提取到的多酚得率为 4.81 mg/g。结合实际生产中的工艺水平，调整到

27、：液料比为 14： 1、双酶添加量为 0.9%、酶解时间为 2 h、 酶解温度为 40 。 为了验证更为可靠的数据，采用上述的工艺条件进行实际提取三次，其结果可以由表5 看到，所得到的多酚得率平均值为 4.83 mg/g，与理论预测值相差 0.02 mg/g。所以，通过上述方法测定出的工艺条件十分的准确可靠。 由表 4 对比实验结果可知，在不加酶条件下提取小米中多酚得率为 3.95 mg/g，比加酶提取工艺低 0.88 mg/g。由此可见，在小米多酚的提取工艺中，通过添加木瓜蛋白酶与 -淀粉酶可以调高小米多酚的含量。 表 4 验证和对比实验结果 验证与对比组编号 验证试验多酚得率 /mg/g

28、未加酶对比试验多酚得 /mg/g 1 4.84 3.96 2 4.80 3.95 3 4.85 3.95 平均值 4.83 3.95 2.3抗氧化能力的对比 通过表 5 可以发现，在木瓜蛋白酶与 -淀粉酶作用后，样品的自由基消除能力有所增加，从未处理样品的 76.51%提高到 83.42%，提升 了 9.03%，抗氧化能力也有所提高，未处理样品为 2.96，处理后样品为 3.67，提升力 23.99%，因此，通过双酶法提取小米多酚不仅可以提升其多酚的含量，也可以提升小米的抗氧化能力。 表 5 抗氧化能力的对比 样品 DPPH自由基消除率 /% 抗氧化能力 双酶处理后样品 83.42 3.67

29、未处理样品 76.51 2.96 3 结论 利用单因素的试验结果为基础，考察了 液料比、双酶添加量、酶解时间、酶解温度 对小米多酚得率的影响。由响应面分析实验得出， 液料比、双酶添加量 是影响小米多酚得率的主要因素，其中 液料 比 的影响最为显著。通过回归分析确定小米多酚提取的最佳工艺 液料比为14： 1、双酶添加量为 0.9%、酶解时间为 2 h、 酶解温度为 40 。这种处理条件下，小米多酚得率可达 4.83 mg/g，比未添加酶处理的样品高 0.95 mg/g。不仅如此，还可以提升小米的抗氧化能力。由验证实验结果可以发现，利用响应曲面优化小米多酚的提取工艺条件在实践上具有可操作性。而酶法

30、辅助提取小米多酚具有条件简便、耗时较短、反映条件温和、经济成本低与高效率的优势，其研究的价值值得肯定。 参考文献 1 Saleh A S M， Zhang Q， Chen J， et al. Millet Grains: Nutritional Quality， Processing， and Potential Health BenefitsJ. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety， 2013， 12(3): 281-295 2 Dykes L， Rooney L W. Sorghum and Millet Phenol

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