肺癌的发病率和死亡率居恶性肿瘤之首非小细胞肺 .doc

1、DC-CIK 联合化疗治疗晚期胃癌的近期疗效观察【摘要】目的 探讨树突状细胞（dendritic cell，DC）共培养细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced killer,CIK）联合化疗治疗晚期胃癌患者的近期疗效。方法 选取 28 例确诊的晚期胃癌患者采用 DC-CIK 联合化疗为联合治疗组，选取临床资料相近的同期进行单纯化疗的 28 例的晚期胃癌患者为对照组，观察两组患者治疗前后外周血中 T 细胞亚群,细胞因子及卡氏评分（Karnofsky KPS）的变化，临床疗效，并记录其不良反应。结果 联合治疗组患者治疗后 CD3+,CD4+,CD56+和 CD4+/CD8+的比例

2、无明显变化（P0.05） ，对照组 CD3+,CD4+和 CD4+/CD8+的比例治疗后明显下降（P60 分，预计生存期超过 6 个月，治疗前心、肝、肾功能大致正常。患者或家属签署知情同意书，本研究经医院伦理委员会批准。表 1 两组病人的临床资料情况Table 1 Distribution of demographic and clinical characteristics in two groups1.2 DC-CIK 细胞培养1.2.1 DC 细胞的体外培养和扩增DC 的体外培养化疗前 2 天采集患者自体外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell

3、, PBMC），用生理盐水洗涤 4 次，然后使用 RPMI 1640 培养基（加拿大维森特公司）调节细胞密度至 2.5106310 6 个 /ml，将细胞接种于 6 孔培养板，置 37、5%CO 2 培养箱孵临床特征 例数 分组 2 P联合治疗组（%） 对照组（% ）性别男 43 21(75.0) 22(78.6) 0.1 0.05女 13 7(25.0) 6(21.4)中位年龄（岁） 59（3679） 62（4177） 58（3679）胃癌部位 贲门部 21 10（35.7） 11（39.2） 胃体部 23 13（46.4） 10（35.7） 0.772 0.05胃窦部 12 5（17.9）

4、 7（25.0） 病理类型低分化腺 13 7（25.0） 6（21.4） 中分化腺 36 17 （60.7） 19（67.9） 0.331 0.05粘液腺 7 4（14.3） 3（10.7） 术后复发转移/晚期（例） 30/26 17/11 13/15转移部位肝 9 4（14.3） 5（17.9） 腹腔 7 4 （14.3） 3（10.7） 肺 7 3 （10.7） 4（14.3） 0.486 0.05盆腔 5 2 （7.1） 3（10.7） 骨 7 3（10.7） 4（14.3）治疗方式 首治/单纯手术 17 8 9 一线化疗 18 11 7 1.56 0.05二线或以上化疗 21 9 12

5、 放疗 5 2 3 治疗前 KPS 评分 56 74.648.81 74.288.36 0.05育 90 min 后吸取未贴壁细胞（peripheral blood lymphocyte，PBL ），于孔中加入 DC 诱导培养液（含 5%自体血浆、100ng/ml rhGM-CSF、50ng/ml rhIL-4），置 37、5%CO 2 培养箱中诱导，第 3 天进行 1/3 换液，第 5 天收获未成熟 DC（imDC ），加入终浓度为 20ng/ml IL-1、5 g/ml PGE-2、20 ng/ml TNF-，诱导 DC 成熟，第 7 天收获成熟 DC（mDC）。1.2.2 CIK 的体外

6、培养PBMC 贴壁培养后收获 PBL，重悬于 5自体血浆 RPMI 1640 培养液中，调整细胞密度至2.5106/ml，铺入预先包被有 anti-CD3 mAb 的 75cm2 培养瓶中，添加 IFN-（1000 U/ml ） ，置于 37、5% CO2 培养箱中孵育，第二天添加 IL-1（终浓度 10 ng/ml） 、IL-2（终浓度250 U/ml） ，继续培养；第 3 天用含 5%自体血浆 RPMI 1640 培养液进行添液，此后实时观察细胞状态适当添液或扩瓶1.2.3 DC 与 CIK 共培养CIK 培养至第 7 天，将细胞合并至一瓶，将收获的 mDC 加入 CIK 细胞悬液中，同时

7、补充自体血浆浓度至 10%，添加 IL-2 至终浓度 250 U/ml，轻轻吹打混匀，按照每瓶 60ml平均分配到 75cm2 培养瓶中，置于 37、5% CO2 培养箱中继续培养，共培养 2-3 天后至细胞达到回输数量可启动回输。1.2.4 DC-CIK 质量控制每次治疗前 24 h 和治疗前 2h，对 DC-CIK 细胞取样，按照中华人民共和国药典2010版方法进行细胞活率、内毒素和革兰氏染色等检测，细胞活率大于 90%，待检测结果均为阴性后收集 9-13d 诱导扩增后获得的 DC-CIK 细胞，0.9%氯化钠溶液洗涤 3 次后配成100ml 液体静脉回输，每天输 1 次，回输（5.00.

8、5）10 8 细胞/次，连续 5 次为一个疗程。1.3 化疗方案 对照组给予 OF 方案: 奥沙利铂 120 mg/（m 2d）d1+5-FU 500 mg/（m 2d） d1-d5，根据不良反应调整剂量。治疗组给予 OF+DC-CIK 方案，患者行化疗前 2 天采集细胞培养 DC-CIK 细胞，第 3 天起行化疗，细胞培养成熟后回输给患者, 28天为 1 个治疗周期，治疗 2 周期后评价疗效。 1.4 疗效判定 参照 RECIST 近期疗效判定标准，每两周期进行评价。采用影像学检查对比治疗前后瘤体大小，分为完全缓解（CR） ，部分缓解（PR） ，稳定（SD）和恶化（PD） 。计算有效率=(C

9、R+PR)/(CR+PR+SD+PD)，疾病控制率（DCR）=(CR+PR+SD)/( CR+PR+SD+PD)，对于 CR 或 PR 的患者，于 4 周后复评。按 NCI急性和亚急性毒性反应的表现和分度标准评价免疫治疗毒性反应。1.5 流式细胞仪术检测 T 细胞亚群及胞内细胞因子的水平抽取患者治疗前后外周血送本院生物治疗中心，分别进行 T 细胞亚群检测，包括 CD3+,CD4+,CD8+,CD56+,CD4+/CD8+；另外同时检测细胞因子，包括 IL-2,IL-10,IL-12,IFN- 和 TNF-。1.6 统计学处理 采用 SPSS17.0 统计软件包录入数据和统计分析，计量资料以（X

10、S）表示，采用 t 检验，率的比较采用 2 检验，P0.05 为差异有统计学意义。2 结果2.1 临床疗效评价实验结果显示（表 2）治疗组完全缓解例 0 例，部分缓解 14 例，稳定 8例，恶化 6 例，有效率达 50.0%，疾病控制率达 78.6%。对照组完全缓解 0 例，部分缓解10 例，稳定 5 例，恶化 13 例，有效率达 35.7%，疾病控制率达 53.6%。两组有效率的比较差异无统计学意义（ 2=1.167，P0.05） ，疾病控制率的比较差异有统计学意义（ 2=3.90，P0.05） 。表 2 治疗后两组患者疗效的比较分析(n)Table 2 Therapeutic effect

11、 of chemotherapy+DC-CIK or chemotherapy on advanced gastric cancer patients(n)+P0.05 vs Chemotherapy2.2 治疗前后外周血淋巴细胞表型变化比较 实验结果显示对照组治疗后患者外周血中CD3+,CD4+细胞比例和 CD4+/CD8+比值较治疗前降低（P0.05）,联合治疗组治疗后与治疗前比较无明显变化（P0.05） ，详见表 3。由此说明本实验室培养的 DC-CIK 细胞可以改善患者的免疫功能。表 3 联合治疗组和对照组治疗前后患者外周血 T 细胞亚群的变化（XS,%）Table 3 Changes

12、 of T cell subgroup in peripheral blood before and after DC-CIK +chemotherapy or chemotherapy （X S,%）+P0.05 vs before treatment in Chemotherapy * P0.05 vs after treatment in Chemotherapy+DC-CIK表 4 联合治疗组和对照组治疗前后患者外周血细胞因子的变化（XS）Table 4 Changes of intra-cellular cytokines in peripheral blood before and

13、 after DC-CIK +chemotherapy or chemotherapy （X S）Group n 完全缓解 部分缓解 稳定 进展 有效率(%) 控制率(%) 2 PChemotherapy+DC-CIK 28 0 14 8 6 50.0 78.6+ 3.9 0.045Chemotherapy 28 0 10 5 13 35.7 53.6Group CD3+ CD4+ CD8+ CD56+ CD4+/CD8+Chemotherapy+DC-CIKBefore treatment 56.885.10 29.814.64 26.923.80 21.945.52 1.110.64Aft

14、er treatment 57.185.10 30.314.70 26.764.26 21.445.27 1.120.53ChemotherapyBefore treatment 58.524.28 30.004.57 26.174.74 25.394.61 1.150.45After treatment 54.684.92+* 26.624.74+* 23.555.12+* 22.984.14+ 1.100.61+*Group IL-2 IL-10 IL-12 IFN- TNF- Chemotherapy+DC-CIK Before treatment 1.520.51 1.880.48 1

15、.650.42 1.640.42 1.650.50After treatment 1.600.45 1.890.49 1.880.41* 1.940.36* 1.600.50ChemotherapyBefore treatment 1.570.32 1.730.43 1.750.36 1.780.41 1.680.5After treatment 1.390.34+ 1.840.50 1.650.38+ 1.750.40 1.580.47+ P0.05 vs before treatment in Chemotherapy * P0.05 vs before treatment in Chem

16、otherapy+DC-CIK2.3 治疗前后外周细胞因子变化比较 试验结果显示，联合治疗组的细胞因子 IL-12 和 IFN- 的水平治疗后有所上升（P0.05） ，IL-10 水平治疗后无明显变化,单纯化疗组 IL-2, IL-12 和 TNF- 的水平治疗后有所下降（P0.05） ，IL-10 有所上升，但是无统计学意义（P0.05） ，详见表 4.结果提示，DC-CIK 免疫治疗增加患者细胞因子的水平，增加患者免疫功能。2.4 胃癌患者生活质量的评价联合治疗组和对照组 KPS 较治疗前评分提高至少 10 分者 23 例（82.14%）和 16 例（57.14%） ，2 组比较差异有统计

17、学意义（ 2=4.139，P0.05）,2 组治疗后疼痛至少减轻 3 分者分别为6 例（60%）和 5 例（41.67%） ，2 组比较差异无统计学意义（ 2=0.733，P 0.05）2.5 DC-CIK 联合化疗的安全性评价28 例患者在 DC-CIK 治疗过程中有 4 例患者出现发热，最高温度达 39 度，持续时间约 12小时，给予处理后可消退，1 例患者出现轻度皮疹，原因不明，给予对症处理后缓解，未发生其他不良反应。3 讨论肿瘤的发生、发展和机体免疫功能息息相关，我国胃癌病人诊断时 85%处于晚期 1，晚期胃癌患者本身肿瘤负荷较重，免疫功能已较低下，加上患者经过手术、放化疗之后免疫功能

18、进一步损伤，这是肿瘤复发和转移的重要原因，60% 的病人术后会出现局部复发和转移 2。化疗只能杀灭一定数量的肿瘤细胞，但是微小残留病灶的清除依赖于调动并增强自身免疫功能清除肿瘤细胞，免疫治疗既能直接杀伤肿瘤细胞，又能调节免疫功能，无明显毒副反应, DC 及 CIK 是该领域极具发展潜力的免疫细胞,DC-CIK 已在各种肿瘤中取得一定的疗效，但是在晚期胃癌中运用报道较少。有研究发现化疗后给予免疫治疗有 1+12 的效益 7，基于以上研究我们将化疗和 DC-CIK 联合治疗应用于晚期胃癌患者。细胞因子诱导的杀伤细胞是将人外周血单个核细胞在体外由多种细胞因子诱导而成的对多种肿瘤具有杀伤活性的细胞毒性

19、 T 细胞。它是同时表达 CD3+,CD56+的异质细胞群，兼具有 T 细胞特异性杀伤及 NK 细胞非主要组织相容性复合体（ MHC）限制性杀伤能力 8。研究发现 CIK 细胞对耐药的肿瘤细胞也有杀伤作用 9,10，这是 CIK 应用于已经耐药的晚期胃癌患者的基础。树突状细胞是目前发现体内功能最强的专职抗原提呈细胞（Antigen-presenting cell APC） ，能摄取、加工及提呈抗原，并能刺激初始型 T 细胞的活化和增殖。DC 细胞能有效呈递抗原多肽，高表达共刺激分子和粘附分子，为 T 细胞活化做准备，分泌大量的抗瘤因子如 IL-2，TNFa 与 IFNr 11,12,13。 D

20、C 和 CIK 共培养可促进 CIK 的体外增殖和成熟，增强 CIK 的细胞毒活性，同时 CIK 也能促进 DC 的成熟，两者相互作用。Marten A6等研究发现 CIK 可以使 DC 高表达 CD80,CD86 和 MHC-I,MHC-II，促使 DC 分泌大量 IL-2，DC 可以促进 CIK 高表达 CD28 和 CD40。 Schmidt14等研究发现 DC-CIK 可降低 CIK 细胞群中的免疫抑制 T 细胞（Treg）而增强抗肿瘤活性。本研究结果显示，联合治疗组患者治疗后外周血中 CD3+,CD4+,CD56+细胞比例和CD4+/CD8+比值较治疗前无明显变化（P0.05） ，对

21、照组 CD3+,CD4+和 CD4+/CD8+的比例治疗后明显下降（P0.05） ，说明 DC-CIK 可以增强患者免疫功能。联合治疗组疾病控制率达 78.6%，对照组疾病控制率达 53.6%，两组疾病控制率的比较差异有统计学意义（P0.05 ） 。联合治疗组和对照组 KPS 较治疗前评分提高至少 10 分者 23 例（82.14% ）和16 例（57.14%） ，2 组比较差异有统计学意义（ 2=4.139，P0.05）,说明 DC-CIK 治疗后可以提高患者生存质量。联合治疗组的细胞因子 IL-12 和 IFN- 的水平治疗后有所上升（P0.05 ） ，对照组 IL-12, IL-2 和

22、TNF- 的水平治疗后有所下降（P0.05） ，TNF-、IL-2、IL-12 刺激 NK 细胞或 CTL 的杀瘤活性，既能抑制肿瘤细胞增殖又能直接杀伤肿瘤细胞，并且能减少肿瘤的复发和转移 15,16。IL-12 和肿瘤进展相关，在患者出现远处转移或恶液质时，IL-12 呈最低水平 17，IFN- 具有较强的抗肿瘤和免疫调节作用等。有研究发现， IFN- 的量与患者疾病进展时间和总生存期成正相关 18DC-CIK 细胞在回输过程中有 6 例患者出现发热，最高温度达 39 度，持续时间约 12 小时，给予处理后可消退，1 例患者出现轻度皮疹，原因不明，给予对症处理后缓解，未发生其他不良反应。综上

23、所述 DC-CIK 联合化疗治疗晚期胃癌具有较好的安全性及有效性。具有较好的临床推广价值。1 Varadhachary G, Ajani JA. Gastric cancer.Clin Adv Hematol Oncol 2005,3(2):118-1242 Ajani JA.Evolving chemotherapy for advanced gastric cancer.Oncologist 2005,10(3):49-583 Malekzadeh R, Nasseri Moghaddam S, et al. Reduction in gastric cancer mortality by

24、 screening based on serum pepsinogen concentration:a case-control study. Scand J Gastroenterol.2007,42(6):760-7644 Larmonier N, Fraszczak J, Lakomy D, et al. Killer dendritic cells and their potential for cancer immunotherapy. Cancer Immunol Immunother 2010，59:1-115 Rosenberg SA, Restifo NP, Yang JC

25、, et al. Adoptive cell transfer:a clinical path to effective cancer immunotherapyJ.Nat Rev Cancer,2008,8(4):299-3086 Marten A, Ziske C, Schottker B, et al. Interactions between dendritic cells and cytokine-induced killer cells lead to an activation of both populationsJ. Journal of Immunotherapy, 200

26、1,24(6):502 -510.7 Pei Zhou,Ping Liang,Baowei dong et al.Phase I clinical study of combination therapy with microwave ablation and cellular immunotherapy in hepatocellular carcinomaJ.Cancer Biology Therapy,2011,11(5):450-4568 Peng Wang, Jin-pu Yu, Song-yuan Gao , et al. Experimental study on the tre

27、atment of intracerebral glioma xenograft with human cytokine-induced killer cells J.Cellular immunology,2008,253(1-2):59-65.9 李世俊，张连生，柴晔 等，树突状细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞共培养对多药耐药肿瘤细胞系的杀伤活性J.中华肿瘤杂志， 2007,29（10）:733-73710 Niu Q,Wang W,Li Y, et al . Cord blood-derived cytokine-induced killer cells biotherapy combine

28、d with second-line chemotherapy in the treatment of advanced solid malignanciesJ. Int Immunopharmacol, 2011, 11(4): 449-456.11 Galluzzi L,Senovilla L,Vacchelli E,et al .Dendritic cell-based interventions for cancer therapy,OncnlmmunologyJ.2012,1(7):1111-113412 Kalinski P, Ravikumar, Muthuswamy, et a

29、l. Dendritic cells in cancer immunotherapy:vaccines and combination immunotherapiesJ.Expert Rev.Vaccines,2013,12(3),285-29513 Lubong R,Sabado,Bhardwaj N,et al .Directing dendritic cell immunotherapy towards successful cancer treatmentJ.Immunotherapy,2010,2(1):37-5614 Schmidt J, Klempp C, Markus W, e

30、t al. Release of ic3b from apoptotic tumor cells induces tolerance by binding to immature dendritic cells in vitro and in vivoJ. Cancer Immunol Immunother,2006,55:31-38.15 Kane A,Yang I,et alInterferon-gamma in brain tumor immunotherapyJ.Neurosurg Clin N Am,2010,21(1) :77-8616 Miwa S,Nishida H,Tanza

31、wa Y,et alTNF- and Tumor Lysate promote the maturation of dendritic cells for immunotherapy for advanced maligant bone and soft tissue tumorsJ.PLOS ONE,2012,7(12):e5292617 Shibata M, Nezu T, kanou H, et al. Decreased production of interleukin-12 and type 2 immune responses are marked in cachectic patients with colorectal gastric cancer J . J Clin Gastroenterol, 2002, 34 (4) : 416 - 420.18 Wheeler CJ, Black KL, Liu G, et al. Vaccination elicits correlated immune and clinical responses in glioblastoma multiforme patients. Cancer Res. 2008, 68(14): 5955-5964.