重组人胸腺肽α1表达与纯化 - 《厦门大学学报（自然 .doc

1、1重组人白细胞介素-13 在大肠杆菌中的表达纯化及鉴定林辉煌 1,2，刘春凤 2，尹凤红 2，丁玉梅 1，陈清西 1*(1.厦门大学 生命科学学院，福建 厦门 361005； 2.厦门特宝生物工程股份有限公司，福建 厦门 361028) 摘要：本文采用大肠杆菌作为宿主表达重组人白细胞介素-13（rhIL-13）融合蛋白，经分离纯化获得高纯度、高活性的 rhIL-13。通过 300 L 发酵罐进行中试发酵表达 rhIL-13 融合蛋白；经 IPTG 诱导，离心发酵液收集菌体，菌体经溶解、变性、稀释复性和亲和层析捕获，获得融合蛋白；融合蛋白经肠激酶酶切后，经亲和层析分离和分子筛精细纯化等步骤后，获

2、得高纯度 rhIL-13 原液。每升发酵液可获得高纯度的 rhIL-13 原液约 30 mg。通过本纯化工艺获得的 rhIL-13 原液经十二烷基硫酸钠 -聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）法检测纯度大于 98.75%；经高效液相色谱分子排阻（ HPLC-SEC）法检测纯度结果为 100%；质谱法分析 rhIL-13 分子质量，结果为 12 348 u，与理论值基本一致；采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法进行比活性检测，检测结果大于 8.0106 IU/mg；采用 HPLC 法和质谱法对rhIL-13 二硫键数目和位置进行了分析，结果显示二硫键数目和位置与理论一致。关键词：重组人白细胞介素-1

3、3；纯化；鉴定中图分类号：Q 3561 文献标志码 ：A 文章编号：白细胞介素-13(IL-13)是一种多功能细胞因子，主要由 T 细胞、嗜碱粒细胞、浆细胞及树突状细胞等在活化状态下分泌产生的，尤其是型辅助性 T 细胞（Th2） 1。IL-13 可诱导单核细胞分化，增强其 MHC类分子的表达 2；抑制 LPS 诱导的单核因子分泌，控制炎症反应；诱导 B 细胞增殖及合成 IgE 类抗体，增强 B 细胞表面 MHC类分子、CD23 及CD72 的表达 3；协同 IL-2 刺激 NK 细胞产生 IFN，从而促进单核巨噬细胞活化和 TH1型细胞免疫反应。IL-13 还具有抑制 HIV-1 在巨噬细胞内

4、复制，诱导中性粒细胞中 IL-1RA基因表达和蛋白质合成等多种功能 4。重组人白细胞介素 -13 为一条非糖基化的单链多肽，含 112 个氨基酸残基，两对二硫键，分子量约为 12.3kD；氨基酸序列为：GPVPPSTALRELIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFN。收稿日期：2016-01-11 录用日期：2016-03-08基金项目：国家高技术研究发展（863）计划（2007AA021604） 2*通信作者： 3目前重组人 IL-1

5、3（rhIL-13）基本上都是采用基因工程方法，通过对其 cDNA 加入特定的标签和引物后，进行 PCR 扩增，插入到质粒中经 DNA 重组后，筛选阳性克隆，转化入感受态的细胞中，进行发酵表达获得融合蛋白，再通过对融合蛋白酶切和下游纯化获得IL-13 蛋白。本文采用基因工程技术构建的高效表达 rhIL-13 融合蛋白的表达菌株进行 300 L 发酵融合蛋白，经变性、复性以及亲和层析、分子筛层析等分离纯化后获得高纯度、高活性的 rhIL-13，为 rhIL-13 工业化生产打下坚实的基础。1 主要材料大肠杆菌BL-21/pCold-IL -13 基因工程菌株由本实验室构建并保存；酵母提取物和蛋白

6、胨为Oxoid公司产品，丙烯酰胺为Promega公司产品；Chelating Sepharose Fast Flow（CS） 、Superdex 75（S-75 ）填料为GE 公司产品；其它试剂均为国产分析纯。实验使用主要仪器：30 L、300 L全自动发酵罐，B Braun Biotech公司；全温振荡器，哈尔滨东明医疗器械厂；离心机，BECKMAN公司；P2B005A01超滤膜，Millipore公司；Basic 100蛋白纯化仪，GE 公司；LC1200高效液相色谱仪，Agilent公司；autoflex III TOF/TOF串联质谱仪，Bruker Daltonics 公司；DU80

7、0紫外 /可见光分光光度计，美国贝克曼公司。 2 实验方法2.1 rhIL-13 融合蛋白的发酵表达挑取 rhIL-13 工程菌株 BL-21/pCold-IL-13，按 1：400（V/V）接种至 100 mL LB 培养基/1 000 mL 三角瓶，pH 6.0、37、200250 r/min 培养 OD600 为 1 左右为一级种；一级种子按 1：200（V/V）接种至 20 L LB 培养基/30 L 种子罐， pH 6.0、37 、200250 r/min培养 OD600 为 10 左右为二级种。二级种按 1：6（V/V）接种到含 120 L LB 培养基的 D300 发酵罐中，pH

8、 7.0、37 ，溶氧（DO） 70% 培养、待菌液浓度达 OD600 约 5.0，将发酵温度降至 15 ，用含 40 mmol/L 异丙基硫代半乳糖苷（ IPTG）的氮源补料液 1.5 L，1 h 内流加诱导，过程中补加碳源或 2 mol/L NaOH 以维持 pH7.0，诱导总时长约 24 h。发酵完毕，离心收集菌体。2.2 融合蛋白变性与捕获取发酵获得菌体 50 g 按 1：10(W：V)的比例重悬于 500 mL 100 mmol/L Tris-HCl、6 mol/L 盐酸胍、30 mmol/L -巯基乙醇（-ME） ，pH8.0 的缓冲液中，冰水浴维持 30 min；用高速冷冻离心机

9、以 10 ，10 000 rpm，20 min 条件离心得上清。4CS 层析柱用 50 mmol/L Tris-HCl、6 mol/L 盐酸胍、3 mmol/L -ME，pH8.0 缓冲液平衡 4 个柱床体积，再将离心上清液上样，然后采用 50 mmol/L Tris-HCl，6 mol/L 盐酸胍、3 mmol/L -ME、 20 mmol/L 咪唑，pH8.0 缓冲液和 50 mmol/L Tris-HCl、6 mol/L 盐酸胍、3 mmol/L -ME、300 mmol/L 咪唑，pH8.0 缓冲液以分步洗脱方式洗脱目的蛋白，收集目的样。2.3 融合蛋白复性捕获的变性蛋白以 1：19(

10、V： V)的比例加入到 100 mmol/L Tris-HCl、0.8 mol/L 盐酸胍、0.5 mmol/L 氧化型谷胱甘肽（ GSSG） 、0.5 mmol/L 谷胱甘肽（GSH） ，pH8.0 缓冲液中。10 左右缓慢搅拌复性 48 h 后，超滤至小体积，再用 1磷酸盐缓冲液（PBS ） ，pH8.0 缓冲液超滤置换掉盐酸胍、GSH 和 GSSG，最后收样。2.4 融合蛋白酶切与纯化将肠激酶（EK）以 1:120（摩尔比）的比例加入到超滤脱盐后样品中，混匀后 10 酶切约 14 hr。CS 层析柱用 30 mmol/L Tris-HCl、30 mmol/L NaCl，pH8.0 缓冲液

11、平衡 5 个柱床体积，酶切后样品上完样后，依次用 30 mmol/L Tris-HCl、30 mmol/L NaCl、50 mmol/L 咪唑，pH8.0 缓冲液； 30 mmol/L Tris-HCl、30 mmol/L NaCl、100 mmol/L 咪唑，pH8.0 缓冲液和30 mmol/L Tris-HCl、30 mmol/L NaCl、300 mmol/L 咪唑，pH8.0 缓冲液进行洗脱，并收集各洗脱峰样品。2.5 S-75 层析柱精纯S-75 层析柱用 1PBS，pH 7.4 缓冲液平衡 3 个柱床体积，取上一步中由 30 mmol/L Tris-HCl、30 mmol/L N

12、aCl、50 mmol/L 咪唑，pH8.0 缓冲液洗脱下来的目的样上样，再用1PBS，pH 7.4 缓冲液洗脱收集目标蛋白。 0.22 m过滤膜过滤除菌，分装即为原液，-65 以下冻存。2.6 rhIL-13 的纯度检测高效液相色谱分子排阻（HPLC-SEC）纯度检测：色谱柱为 TSK GEL 2000 SWxl 排阻柱，规格为直径 7.8 mm，柱高 300 mm，粒径 5 m，孔径 125 ，球蛋白分子质量分离范围 5150 ku；样品稀释到 0.2 mg/mL，取 50 L 上样色谱柱，以 0.1 mol/L PBS(pH7.0)-0.1 mol/L NaCl 溶液为流动相洗脱，流速

13、0.7 mL/min，柱温室温，检测波长 280 nm。按面积归一化法计算总的杂质峰面积占总峰面积的百分数得出 rhIL-13 的 HPLC-SEC 纯度。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（ SDS-PAGE）纯度检测：取纯化后的蛋白溶液，按质量分数 1.25%（250 ng）、2.5% (500 ng)、5% (1 g)、100% （20 g）的上样量进行5SDS-PAGE 电泳分析。分离胶浓度 16%；上样量 20 g，电压 80 100 V，考马斯亮蓝G250 染色。还原型方法步骤同非还原型，但使用 2还原型上样缓冲液（取 1mol/L 二硫苏糖醇（DTT）与 2.5非还原型上样缓冲液

14、按 1：4 混合）。2.7 rhIL-13 的理化性质分析采用 BRUKER 公司 REFLEXTM 型基质辅助激光解吸电离/ 飞行时间（MALDI-TOF MS）质谱仪， MALDI-TOF MS 法测定 IL-13 分子质量；基质为 -氰基-4-羟基肉桂酸；蛋白分子量标准品采用 BRUKER 公司之 Protein Calibration Standard，分析软件为flexAnalysis Ver.3.0.54.0。利用人红白血病细胞系（TF-1）细胞具有对 hIL-13 依赖生长的特性，采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法对 rhIL-13 进行活性测定。标准品来自 R&D 公司，比活性为

15、7.8105 IU/mg。采用 Agilent LC1200 高效液相色谱仪和 Autoflex TOF/TOF 串联质谱仪进行二硫键分析，先用胰蛋白酶酶切后，HPLC 收集二硫键连接的肽段，再用 -糜蛋白酶酶切分析二硫键连接方式。3 纯化结果分析3.1 rhIL-13 融合蛋白的发酵表达在发酵过程中不同诱导时间的发酵液进行取样，扫描后取相同 OD600 的菌体，高温破碎， SDS-PAGE 电泳检测，试验结果见图 1，rhIL-13 融合蛋白表观分子质量约为 17 ku，随着诱导时间的延长，发酵的目的产物逐渐增加，随着时间的延长可以获得更多的生物量的积累。300 L 发酵罐最终可获得发酵液约

16、 120 L，离心可获得约 2 kg 菌体。lane18：rhIL-13 诱导不同时间样品；lane10：marker 。图 1 IL-13 发酵过程菌体裂解液电泳图6Fig.1 Analysis of IL-13 fermentation by SDS-PAGE3.2 融合蛋白变性与捕获菌体经溶解和融合蛋白包涵体溶解后，蛋白处于变性状态。发酵表达的融合蛋白 N 末端带有 6 个 His 氨基酸，可特异性与 CS 层析填料结合。纯化洗脱图谱见图 2 中 A，图中 I号峰为未挂柱的杂蛋白，号峰为上样后预冲洗下来的杂质，号峰为目标蛋白，共 250 mL，检测蛋白浓度为 1.88 mg/mL。号样品

17、电泳结果见图 3 中 lane1。A. rhIL-13 融合蛋白的 CS 捕获图谱；B. rhIL-13 的 CS 层析纯化图谱；C. rhIL-13 的 S-75 层析图谱。图 2 rhIL-13 的捕获与分离纯化的层析图谱Fig.2 Chromatogram of rhIL-13 during capture and purification processlane 1：变性后融合蛋白捕获样；lane 2：复性后超滤样品；lane 3：融合蛋白酶切后样品；lane 4：酶切样品 50 mmol/L 咪唑洗脱样；lane 5：酶切样品 100 mmol/L 咪唑洗脱样；lane 6：酶切样品

18、 300 mmol/L 咪唑洗脱样；lane 7：酶切样品 50 mmol/L 咪唑洗脱样品过 S75 柱主峰样品；lane 8：酶切样品 50 mmol/L 咪唑7洗脱样品过 S75 柱主峰前样品（ -DTT） ；lane 9：酶切样品 50 mmol/L 咪唑洗脱样品过 S75 柱主峰前样品（+DTT ） 。图 3 SDS-PAGE 法分析纯化过程各样品Fig.3 Analyse the samples of rhIL-13 during purification process through SDS-PAGE3.3 变性蛋白复性与超滤号峰经稀释后复性 48 h 后，超滤去除盐酸胍、GS

19、H 和 GSSG 等，同时进行缓冲液替换，最后超滤收样 200 mL，检测蛋白浓度为 1.1 mg/mL，样品电泳结果见图 3 中 lane2。3.4 融合蛋白的酶切与纯化按超滤后样品蛋白量的 120：1（摩尔比）加入 EK，10 酶切 14 h。酶切后样品电泳见图 3 中 lane3。CS 纯化柱纯化过程如图 2 中 B 所示，三种洗脱液洗脱下来的样品分分别收集，I 号样品(40 mL，检测蛋白浓度为 3.1 mg/mL)用于下一步纯化步骤；三个样品分别进行电泳检测，结果分别为图 3 中 lane4、lane5 和 lane6。CS 层析柱分离后的 I 号样用 S-75 分子筛纯化和缓冲液置

20、换，收集目的样；其洗脱见图 2 中 C，共收集两个峰，图 3 中，II 号峰电泳为 lane7， lane8 和 lane9 分别为 I 号峰的电泳，其中 lane9 中样品加了 DTT 。样品用 0.22 m 过滤膜过滤除菌，分装即为原液，-65 以下冻存。3.5 纯化过程各样品电泳与收率分析从图 3 中 lane 1 可以看出，经变性捕获后，菌体相关蛋白杂质已基本去除，融合蛋白纯度较好；从 lane 2 可以看出超滤操作对样品电泳纯度基本上没有影响；从 lane 3 可以看出，融合蛋白酶切较完全；从 lane 4、5 和 6 可以看出，酶切后产物被有效分离，主要目的样在 I 号洗脱中，号和

21、号洗脱样品主要为杂质；从 lane7 可以看出，样品经 S-75 纯化后，纯度较高，杂质进一步得到去除；从 lane 8 和 9 可以看出，杂质主要是二聚体杂质。纯化过程各步蛋白收率见表 1，由于菌体溶解后样品中含大量菌体蛋白，扫描定量不准，因此未定量。从表 1 可以看出，捕获后到原液总收率 22.5%左右。表1 纯化中各步收率Tab.1 The yield of each operation step during purification纯化步骤 目的样体积/mL目的样质量浓度/(mgmL-1)收到蛋白量/mg 收率/%融合蛋白捕获 250 1.88 4708融合蛋白复性 200 1.1

22、220 46.8酶切后 CS 柱纯化 40 3.1 124 56.4S-75 柱纯化 64 1.65 106 85.5总收率 / / / 22.54 原液检测分析4.1 rhIL-13 原液活性检定采用TF-1/MTT比色的方法测定IL-13 的效价。rhIL-13能促进TF-1细胞的增殖，且TF-1细胞增殖数量与培养体系中rhIL-13 含量成剂量依赖性；MTT 在活细胞的线粒体中可以定量的被还原为蓝色的甲臜，通过比色法测定甲臜的量可以直接表示TF-1细胞的生长状态。标准品来自R&D，进行3组平行实验， 3次测定结果RSD值小于 10%。结果见表2。表2 rhIL-13比活性结果Tab.2

23、Specific activity of rhIL-13名称 样品浓度 平行实验 生物学活性 /(106 IUmL-1) 比活性/(10 6 IUmg-1)标准品 50 g/mL / 0.039 0.781 16.9 10.22 14.7 8.9IL-13 1.65 mg/mL3 16.8 10.2/ / 平均 16.1 9.8/ / RSD 7.7% 7.7%4.2 SDS-PAGE 电泳检测结果用非还原型和还原型 SDS-PAGE 法检测。分别上样控制带 1.25%，2.5% ，5%和10%，电泳结果（见图 4）表明： 1.25%的蛋白条带亮于目的样品的杂质带， rhIL-13 的杂质含量

24、低于 1.25 %，即 rhIL-13 的电泳纯度大于 98.75%。9lane1：rhIL-13 250 ng； lane2：rhIL-13 500 ng； lane3：rhIL-13 1 g ；lane4 ：rhIL-13 20 g；lane5：MK；lane6：rhIL-13 250 ng； lane7：rhIL-13 500 ng； lane8：rhIL-13 1 g；lane9：rhIL-13 2 g；lane10：rhIL-13 20 g。图 4. SDS-PAGE 法测定 rhIL-13 纯度Fig.4. Determination of purity of rhIL-13 by

25、 SDS-PAGE4.3 HPLC 检测结果rhIL-13 的 HPLC-SEC 的检测结果见图 5，从图中可以得知，按面积归一化法计算，检测样品中 rhIL-13 的峰面积占总面积的 100 %，即 rhIL-13 原液的 HPLC-SEC 纯度为 100 %。图5 HPLC-SEC法测定rhIL-13纯度Fig.5 Determination of purity of rhIL-13 by HPLC-SEC4.4 rhIL-13 的质谱分子量检测MALDI-TOF 测定 rhIL-13 的分子质量，结果发现 rhIL-13 的质谱分子质量为 12348 u（见图 6） ，分子量大小与 rh

26、IL-13 理论分子质量（12312 u）基本一致。10图 6 MALDI-TOF MS 法测定 rhIL-13 分子质量Fig.6 Determination of mass spectrum of rhIL-13 by MALDI-TOF MS4.5 rhIL-13 的二硫键分析rhIL-13 分子中含 4 个半胱氨酸，理论上其第 28 位的半胱氨酸和第 56 位的半胱氨酸形成二硫键，第 44 位的半胱氨酸和第 70 位的半胱氨酸形成二硫键。取两份样品（其中一份 DTT 处理）分别用胰蛋白酶酶切后，进行肽图比较分析，得知50.7 min 样品为含二硫键肽段。将些肽段用 -糜蛋白酶酶切后肽图

27、得 36.2 min、38.8 min和 43.8 min 三个样品，对这 3 个质谱峰进行二次解析，在分子质量 1 522 u（36.2 min）和分子质量 2 395 u（43.8 min）的二次图谱中可以发现二硫键的特征谱图。再分别取 36.2 min 和 43.8 min 的样品上质谱分析，同时上一份加 DTT 处理过的进行对比，除了分子质量为 506 u 的肽段较小，且得质子能力较弱，未在图谱中找到，其它 3 个肽段（分子质量分别为 1 019，1 077，1 320 u）均有找到，结果如表 3 所示。表3 rhIL-13二硫键结果Tab.3 Result of disulfide bond of rhIL-13保留时间/min 分子质量/u 匹配肽段 +DTT 后分子质量 /u +DTT 后匹配肽段36.2 1522 1019(506) MLSGFC70PHK(C44AALE)38.8 991 SINLTAGMY43.8 2395 10771320 APLC28NGSMVWSLINVSGC56SAIEKrhIL-13 原液二硫键的连接情况为 C28-C56 和 C44-C70，与理论位置一致，如图 7。