泛素化修饰与DNA损伤应答.DOC

1、 http:/ - 1 - 中国 科技论文在线 泛素化修饰与 DNA损伤应答 张琪婷 1， 赵红昌 1， 许兴智 2*作者简介： 张琪婷（ 1993 年生），女，本科生，主要研究方向为 DNA 损伤应答 通信联系人： 许兴智（ 1967 年生），男，教授，博士生导师， DNA 损伤应答北京市重点实验室主任，从事DNA 损伤应答与癌症的研究 . E-mail: xingzhi_ （ 1. 首都师范大学 DNA损伤应答北京市重点实验室，北京 100048； 2. 首都师范大学 DNA损伤应答北京市重点实验室，北京 10048） 5 摘要 ： 翻译后修饰是人蛋白质组复杂性的核心机制之一，参与调控几乎

2、所有的细胞活动。泛素化修饰是常见的一种翻译后修饰。本文简要综述泛素化修饰参与 DNA损伤应答调控的最新进展 。 关键词 ： DNA损伤应答 ； 泛素化 ； RNF8； RNF168 10 中图分类号 ： 请查阅中国图书馆分类法 Ubiquitination and DNA Damage Response ZHANG Qiting1, ZHAO Hongchang2, XU Xingzhi3 (1. Beijing Key Laboratory of DNA Damage Response, Capital Normal University, Beijing 15 100048; 2. Bei

3、jing Key Laboratory of DNA Damage Response Capital Normal University, Beijing 100048; 3. Bejing Key Laboraotory of DNA Damage Response, Capital Normal University, Beijing 100048) Abstract: Post-translational modifications (PTMs) are the key mechanisms of the human 20 proteome complexity, modulating

4、almost every aspect of cellular activities. Ubiquitination is one of common PTMs. This brief review summarizes the recent development of ubiquitination in DNA damage response. Key words: DNA damage response, ubiquitination, RNF8, RNF168 25 0 引言 翻译后修饰是蛋白质生物合成后发挥功能过程中的一步。核糖体以信使 RNA 为模板、20 种氨基酸为原材料合成全新

5、的多肽链（ Polypeptide chains）。这些多肽链经过翻译后修饰等生物过程而变成为成熟的、具有生物功能的蛋白质。翻译后修饰是在多肽链的特定氨基酸上以共价键的形式添加化学官能团或其它蛋白质 /多肽，或是对蛋白质的酶切，或是蛋白质30 的降解，或是非酶性修饰（如 deamination）等，从而赋予这些被修饰蛋白的新功能。虽然人基因组仅编码约 20000-25000 个基因，但是人蛋白质组含有超过一百万种的蛋白质（图 1）。这种从基因组到蛋白质组的复杂性主要来自两方面： 1）基因组重组、利用不同启动子开始转录、选择性剪接及利用不同的转录终 止机制等导致一个基因可形成多个转录本； 2）超

6、过2 百种的翻译后修饰、超过 20 万实验证实的修饰位点和超过 20 万潜在的的修饰位点35 （ http:/dbptm.mbc.nctu.edu.tw/statistics.php），这些修饰种类和位点的组合赋予蛋白质各种可能的功能。 蛋白质翻译后修饰主要包括磷酸化、糖基化、乙酰化、泛素化、甲基化等，参与调控蛋白质的活性、细胞内定位、与生物大分子（如蛋白质、核酸、脂类等）的相互作用 (Ulrich, 2012; Ye and Rape, 2009)。其中，蛋白质的糖基化修饰最为常见，估计超过 50%的蛋白质带40 有糖基化修饰，但是，由于糖基化修饰鉴定技术的限制，目前实验证实的糖基化修饰位点

7、有http:/ - 2 - 中国 科技论文在线 限，其生物学功能的研究更是有待深入。蛋白质的磷酸化修饰次为常见，约有 1/3 的蛋白质被磷酸化修饰。由于磷酸化修饰的鉴定技术和 检测技术的成熟并被广泛应用，这类修饰的功能研究最为深入和透彻。 45 图 1： 翻译后修饰是蛋白质组多样性的核心机制。人基因组仅编码 2.0-2.5 万个基因，但是蛋白质组含有超过一百万种。转录水平和 mRNA 水平的改变导致转录组数目是基因组基因数目的 4-5 倍，而众多且 各异的翻译后修饰指数般地增加蛋白质组的复杂性。 （ http:/ 50 1 泛素化修饰 泛素化修饰是常见的翻译后修饰之一。用胰蛋白 酶酶解细胞蛋白

8、质组后，用识别含有双甘氨酸（ diglycine, diGly）异构肽的抗体来富集并用质谱分析，发现超过 5000 种的蛋白质被泛素化修饰 (Kim et al., 2011)。泛素基因在各个物种中均高度保守，编码包含 76 个氨基酸的蛋白质，含有特征性的碳末端甘氨酸（ diGly）和 7 个赖氨酸残基（ K6、 K11、 K27、 K29、55 K33、 K48 和 K63） (Messick and Greenberg, 2009)。泛素化修饰简单来说就是泛素分子与靶蛋白之间 的共价连接，这个过程需要泛素激活酶（ E1）、泛素偶合酶（ E2）和泛素连接酶（ E3）来共同完成。人基因组编码

9、2 个 E1、至少 35 个 E2 偶合酶和至少 617 个 E3 连接酶。首先，泛素被 E1 激活，这是依赖于 ATP 的两步激活过程。第一步是 E1 同时结合 ATP 和泛素并催化泛素分子碳末端的酰基腺苷酸化。第二步将泛素分子传送到 E1 的活性位点半胱氨60 酸残基上，同时释放 AMP，导致泛素分子碳末端和 E1 半胱氨酸的巯基之间形成硫酯键。其次， E2 同时与活化的泛素分子及 E1 结合，将活化的泛素分子传递给 E2 的活化位点半胱氨酸残基上并形成硫酯键。 最后， E3 催化泛素修饰的最后反应 (Tang and Greenberg, 2010)，在活化的泛素分子碳末端的甘氨酸残基和

10、底物分子的某个赖氨酸残基间形成异构肽键，在此基础上，另一个活化的泛素分子碳末端的甘氨酸残基与前一个泛素分子的某个赖氨酸残基或 N65 端的甲硫氨酸形成异构肽键，依此类推，从而形成多泛素化链 (Ye and Rape, 2009)。 泛素化修饰主要有两大类：单泛素化修饰（ monoubiquitination）和多泛素化修饰（ polyubiquitination）。顾名思义，单泛素化修饰是在底物的某个赖氨酸残基上以共价键结合的方式加上单个泛素分子。这种修饰可以发生在底物的多个赖氨酸残基上，目前研究这类修饰不参与蛋白酶体介导的蛋白质降解，而主要是活化底物蛋白的功能。 如增殖细胞核抗原70 (PC

11、NA)的单泛素化可以修复 DNA 交联，减少 DNA 双键断裂，并且使癌细 胞对铂化合物不敏感 (Inoue et al., 2014)。 多泛素化修饰相对于单泛素化修饰来说要复杂得多。 K48 聚泛素化http:/ - 3 - 中国 科技论文在线 是最早发现的、也是被最深入研究的泛素化修饰方式，促进被修饰靶蛋白通过 26S 蛋白酶体进行降解。 K63 聚泛素化与底物蛋白的蛋白酶体降解无关，而是允许其它细胞活动进程（如细胞内运输、炎症反应、蛋白翻译和 DNA 修复等）协调有序地进行 (Ye and Rape, 2009)。其75 它赖氨酸残基及 N 端甲硫氨酸残基介导的聚泛素化的功能还有待解析

12、。分支聚泛素化（ branched polyubiquitination）指在同一聚泛素化链上含有不同赖氨酸残基介导的聚泛素化链。如果不同的泛素化修饰方式（如单泛素化、不同赖氨酸残基介导的聚泛素化、分支的聚泛素化）赋予被修饰底物不同的空间构象和功能，同时每一个蛋白很可能含有多个赖氨酸残基，这样的 话，多个位点的不同泛素化修饰的组合给予了人蛋白质组各种可能的功能。由此80 可见，泛素化修饰参与了细胞内几乎所有的生命活动，当然也包括 DNA 损伤应答。 2 DNA 损伤修复 基因组 DNA 存储着生物体赖以生存和繁衍的遗传信息，因此维护基因组 DNA 的稳定性和完整性对生物体来说至关重要。然而，众

13、多外界环境因素和生物体内部因素都会导致基85 因组 DNA 分子的损伤或改变。内部因素包括代谢过程所产生的氧自由基等，物理因素如太阳光中紫外线、电离辐射等，化学因素如烷化剂、碱基类似物等都会造成 DNA 的损伤 (Dong and Huen, 2011)。如果这些 DNA 损伤不能被有效且高保真修复的话，就会造成核苷酸序列甚至染色体 结构的不可逆改变，这样就会增加肿瘤发生率，危害细胞和机体的生存 (Jackson and Bartek, 2009)。幸好在我们机体中存在着一套 DNA 损伤应答（ DNA damage response, 90 DDR）的保护机制来维持基因组 DNA 的稳定性和

14、完整性 (Ciccia and Elledge, 2010)。 DDR 基因缺陷是许多人类疾病，尤其是癌症和衰老的主要致病因素。从另一方面来看， DDR 是癌症主要治疗手段如放射治疗和大多数化学治疗的作用机制。因此，对 DDR 的透彻研究不仅有助于阐明癌症发生和发展的分子机制和癌细胞耐药的分子机制，同时对癌症的临床治疗具有指导意义，也为开发新的抗癌药物奠定理论基础。 95 图 2： 众多外界 环境因素和生物体内部因素都会导致基因组 DNA 分子的损伤 ，化疗和放疗是目前治疗 DNA损伤的主要方法，而生物体内也会启动一系列修复机制来保持其基因组稳定性和完整性。若不可修复，则细胞死亡；若能正确并高

15、保真地修复，则细胞得以继续生存繁殖；若错误修复，就会导致其 核苷酸序列甚至染色体结构的不可逆改变 ，增加肿瘤发生率，危害细胞生存。 100 http:/ - 4 - 中国 科技论文在线 2.1 DNA 损伤应答（ DDR） DDR 包括一系列复杂的蛋白修饰，诱发 DNA 修复所需的核染色质构象变化，终止细胞周期，激活、积累并储存所需的 DDR 因子 (Gieni et al., 2011)。 DDR 其实 也 是个信号传递的过程，包括对 DNA 损伤信号的识别和检测、损伤信号的传递及损伤效应（ Damage effects）。DNA 损伤效应可以说是全面的、综合性的，影响到几乎所有的细胞生命活

16、动，包括最近发105 现的 DNA 损伤引起高尔基体的改变 (Farber-Katz, 2014)。主要的 DNA 损伤效应包括 1）激活细胞周期检验点，将细胞周期暂时停滞在某个时相，从而允许细胞有时间对损伤的 DNA 进行修复； 2）如果 DNA 损伤过于严重而不能被修复时，则诱发细胞程序性死亡。 DDR 是一项复杂而又精准的系统工程，在很大程度上是由参与这些过程的修复因子的110 翻译后修饰来协调运作的。最常见的、研究地最透彻的参与 DDR 翻译后修饰当属磷酸化修饰，其中 DNA 损伤感应激酶 ATM/ATR/DNA-PKcs、效应激酶 CHK1/CHK2 介导的磷酸化修饰调节着 DDR

17、的方方面面 (Bensimon et al., 2011)。最近几年， 泛素家族与 DNA 损伤应答之间的关系被 众多实验室 关注到， 对泛素化修饰在 DDR 中的作用开展了一系列的探索 ，并逐渐将泛素化作为 DDR 的一个热点问题，而目前主要被关注的是不同的 DDR 蛋白如何以115 组蛋白单泛素化和 K63 多泛素化方式被招募到 DNA损伤部位 (Ramadan and Meerang, 2011)。随着深入的研究，泛素化在 DNA 损伤应答中的作用显得越来越重要，从 DNA 损伤的感知，到损伤信号的延续传递，然后启动修复机器来完成修复以及修复完成后修复机器的解离清除，每一个步骤都会有泛素

18、化修饰的参与 (Wouters, 2011)。目前关注最多的是最早被募集到DNA 双链断裂处（ DNA double-strand break, DSB）的 E3 连接酶 RNF8/RNF168(Bekker-Jensen 120 and Mailand, 2011; Lilley et al., 2010; Pinder et al., 2013)。 2.2 DNA 双链断裂处（ DSB）修复 DSB 被认为是最具 毁灭性的 DNA 损伤类型，单个未被修复的 DSB 足以诱导细胞凋亡。在针对 DSB 的 DDR 过程中，高等真核生物体内会有一连串泛素修饰事件的发生。这是由激125 酶 ATM

19、/ATR 对组蛋白变异体 H2AX 和 DNA 损伤介导因子 1（ MDC1）磷酸化引发的 (Eliezer et al., 2014; Gieni et al., 2011)。目前的研究发现，这些磷酸化事件招募两个重要的泛素连接酶 RNF8 和 RNF168 到损伤位点，这些酶在后继过程中对有关组蛋白和其他参与损伤修复的蛋白质进行泛素化修饰，级联放大信号，来招募更多的损伤修复因子来完成修复 (Lilley et al., 2010)。 130 现在 已经证明，瓣状核酸内切酶 1（ flap endonuclease, FEN1）的降解需要磷酸化来引起泛素化 (Guo et al., 2012

20、)，此外还有 越来越多的证据表明泛素化信号的起始是在磷酸化事件发生之后，由 RNF8 驱动对一系列因子诸如组蛋白进行泛素化。 RNF8 具有跟不同的泛素 偶合 酶 E2 形成复合体来催化不同 形式泛素链形成的能力，这些泛素化形式或是 K63 位连接或135 http:/ - 5 - 中国 科技论文在线 是 K48 位连接 (Feng and Chen, 2012)，这是一个起始，随后另一个泛素连接酶 RNF168 会以RNF8 依赖的形式被募集到损伤位点， RNF168 一般认为只是会催化 K63 泛素化链的形成。研究表明，在初始阶段 RNF168 对组蛋白 H2A 的 K13 和 K15 位

21、点进行单泛素化修饰，至此第一波的泛素化修饰事件完成 (Mattiroli et al., 2012; Pinato et al., 2009)。单泛素化修饰的组蛋白也许只是提供一个平台来募集一些已知的或未知的修复因子，后继过程 RNF8 与 RNF168140 协调运作在组蛋白单泛素化的基础上进行链的延伸，一般认为这时候主要进行的是 K63 位泛素链的加成，这通常被认为是组蛋白单泛素化形成后第二波大规模泛素化事件的发生，这样就会将损伤信号传递并扩大来招募下游的修复因子 (Pinder et al., 2013)。此外，在 RNF8 跟RNF168 之后，另一个重要的 E3 连接酶 乳腺癌易感

22、蛋白 1（ breast and ovarian cancer susceptibility protein 1, BRCA1）会以泛素化依赖的方式被募集到损伤位点。 BRCA1 能催化145 K6 连接的泛素化链形成， 而且 K6 泛素化链 似乎可以使底物更稳定而不被蛋白酶体水解(Ohta et al., 2011)，但 具体功能仍没有阐释清楚， 也许 BRCA1 会在 RNF8 跟 RNF168 之后促使 另一拨泛素化事件的发生 。在 Ring Finger 家族中，还有一类蛋白会阻碍 DSB 信号的传递和修复因子的聚集，如 RNF169(Chen et al., 2012)。 最近还发现

23、参与 mRNA 剪接的 E3 连接酶 PRP19 通过与 RPA 的相互作用而识别损伤的 DNA，对 RPA 进行泛素化修饰，从而促150 进 ATRIP 的募集和 ATR-CHK1 轴的激活 (Marechal, 2014)。综上所述，我们认为泛素化修饰可能贯穿整个 DDR 进程。 3 展望 最近几年的研究表明泛素化修饰和类泛素化修饰分子在 DNA 损伤应答中具有重要作155 用，但是其具体机制还有待揭示。尽管现在有很多底物被发现，但其具体修饰位点还是没有确定。目前在泛素化修饰介导的 DSB 应答还有很大空白，例如 RNF168 以依赖于 RNF8 催化 活性的机制被招募到损伤位点等都还没有

24、被阐述清楚， DNA 损伤修复完成后如何移除这些泛素化修饰等。每个蛋白的泛素化修饰位点的鉴定及其功能、每个蛋白的多个泛素化修饰位点和多种修饰方式的生物学功能、每个蛋白上的泛素化修饰与其它翻译后修饰的 crosstalk160 等亟待我们去阐明，而每条信号通路、每个 DDR 效应及整个细胞直至个体的翻译后修饰的综合功能的阐释更是巨大的挑战。 参考文献 (References)1 Ulrich, H.D. (2012). Ubiquitin, SUMO, and phosphate: how a trio of posttranslational modifiers governs protein

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33、DNA Damage Responses. 195 Current Molecular Medicine 11, 152-169 15 Bekker-Jensen, S., and Mailand, N. (2011). The ubiquitin- and SUMO-dependent signaling response to DNA double-strand breaks. FEBS letters 585, 2914-2919. 16 Lilley, C.E., Chaurushiya, M.S., Boutell, C., Landry, S., Suh, J., Panier,

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40、NA damage. The Journal of biological chemistry 287, 27715-27722. 25 Marechal, A., Li, J.M., Ji, X.Y., Wu, C.S., Yazinski, S.A., Nguyen, H.D., Liu, S., Jimenez, A.E., Jin, J., and Zou, L. et al (2014). PRP19 Transforms into a Sensor of RPA-ssDNA after DNA Damage and Drives ATR Activation via a Ubiquitin-Mediated Circuitry. . Molecular cell 53, 235-246. 225