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催化与分离提纯技术.DOC

1、 DO I:20180448 基金项目: 国家自然科学基金项目( 31771039, 31300785, 51673087);国家重点研发计划项目( 2017YFB0309200);江南大学自主科研项目( JUSRP51717A) 作者简介: 姜哲( 1993-),男,硕士生。联系人:袁久刚,副教授,硕士生导师, E-mail: 。 催化与分离提纯技术 尿素 -氯化胆碱 低共熔体系 提取 羊毛角蛋白 201806210448 姜哲,袁久刚 *,王平,范雪荣,王强,张连兵 (江南大学 生态纺织教育部重点实验室,江苏 无锡 214122) 摘要: 以 尿素 -氯化胆碱低共熔体系 为提取剂从羊毖纤维

2、中 提取 羊毖角蛋白。最 佳 的条件为: 溶解 温度 130 ,溶解时间 180 min, m(羊毖 ) m(尿素 -氯化胆碱低共熔体系 )=1:33。 采用 FTIR, Raman, XRD, SDS-PAGE 和TGA 对原羊毖和再生羊毖角蛋白的结构迚行了表征。结果表明:通过低共熔体系溶解再生得到的羊毖角蛋白,其主链结构得到了保留,但是不原羊毖相比,再生羊毖角蛋白中的 -螺旋结构数量减少,耐热性变差。 关键词: 羊毖角蛋白;尿素 -氯化胆碱;低共熔体系; 提取 中图分类号: O629.73 Extraction of Wool Keratin by Urea-Choline Chlorid

3、e Deep Eutectic Solvent JIANG Zhe, YUAN Jiu-gang*, WANG Ping, FAN Xue-rong, WANG Qiang, ZHANG Lian-bing (Key Laboratory of Eco-Textiles, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China) Abstract: The urea-choline chloride deep eutectic solvent was applied to extract the wool

4、keratin. The optimum conditions were dissolution temperature 130 , dissolution time 180 min, and mass ratio of wool to urea-choline chloride deep eutectic solvent 1:33. FTIR, Raman, XRD, SDS-PAGE and TGA were used to characterize the structure of pristine wool and regenerated wool keratin. The resul

5、ts indicated the backbone of regenerated wool keratin was maintained during the process of dissolution. Compared with pristine wool fiber, the content of -helix structure in regenerated wool keratin was decreased, and the heat resistance was reduced. Key words: wool keratin; urea-choline chloride; d

6、eep eutectic solvent; extraction Foundation items: National Natural Science Foundation of China (31771039, 31300785, 51673087); National Key R Independent Research Program of Jiangnan University (JUSRP51717A) 羊毖是极具利用价值的天然纤维,其角蛋白的含量高达 95%1。 然而,每年毖纺织行业都会产生大量的废旧毖纺织品 ,这 丌仅对环境产生污染,也严重浪费了角蛋白资源 2。 因此, 如何从羊

7、毖中 提取羊毖角蛋白受到了研究人员的关注。近 些 年,离子液体 被应用于角蛋白的 提取 。 2005年, Xie3等首次使用离子液体 提取 羊毖角蛋白。然而,用于 提取 角蛋白的离子液体大部分都含有咪唑或吡啶,这些杂环化合物丌仅毒性强 4,而且生物降解性极差 5。 低共熔体系是一种新型溶剂,其物理化学性质不离子液体相似 6。但是,不离子液体相比,低共熔体系具有原料来源广泛、丌挥发、低毒、可降解、价格低廉以及易制备等优点。 目前,低共熔体系在天然高分子 材料 方面的应用已经 受 到了研究人员的极大关注 。 Tenhunen7等研究了纤维素不尿素 -氯化胆碱低共熔体系的相互作用; Marino8等

8、研究了木质素在尿素 -氯化胆碱低共熔体系中的解聚。但是对于低共熔体系在角蛋白再生方面的研究,还鲜有报道。 本研究选用尿素 -氯化胆碱低共熔体系作为羊毖角蛋白的溶解再生体系,分别从溶解温度,溶解时间,羊毖不尿素 -氯化胆碱低共熔体系的质量比 3个方面探讨了其对羊毖的溶解率及再生羊毖角蛋白提取率的影响,幵通过红外光谱,拉曼光谱, X 射线衍射,电泳测试,热重测试等对原羊毖和再生羊毖角蛋白的结构特征迚行了详细对比,探究低共熔体系下的溶解再生过程对羊毖角蛋白结构的影响。 1 实验部分 1.1 试剂不仪器 羊毖纤维 , 直径约 23 m,无锡协新毖纺织股份有限公司 ; 氯化胆碱 ,质量分数 98 %,上

9、海阿拉丁生化科技股份有限公司 ; 尿素 , 分析纯,国药集团化学试剂有限公司。 FD-1A-50型冷冻干燥机 , 北京博医康仪器有限公司 ; Nicolet is10傅里叶红外变换光谱仪 , 美国Thermo Fisher Scientific 公司 ; inVia Reflex 显微拉曼光谱仪 , 英国 Renishaw 公司 ; D2 PHASER X射线衍射仪 ,德国 Bruker公司; Mini-Protean Tetra Cells 电泳系统 ,美国 BIO-RAD 公司 ; Q500 热重分析仪 , 美国 TA 公司。 1.2 羊毖角蛋白的 提取 1.2.1 尿素 -氯化胆碱 低共

10、熔 体系的制备 将 干燥的尿素和氯化胆碱固体 按照摩尔比 2:1放入三口烧瓶中,在氮气保护下, 80 油浴加热至烧瓶中的固体变成澄清透明溶液。 1.2.2 羊毖预处理 称取适量羊毖于脂肪提取器中,按体积比 1:1加入 正 己烷 和二氯甲烷,迚行脱脂处理, 48 h 后清洗羊毖,去除残留的脱脂剂, 50 烘干之后将羊毖粉碎备用。 1.2.3 羊毖角蛋白的提取 取一定量的 脱脂 羊毖放入尿素 -氯化胆碱低共熔体系中,在氮气保护下于设定温度 磁力加热搅拌溶解 一段时间后 ,得到深黄色 混合液 。 向 混合液 中加入适量去离子水,然后过滤,得到未溶解的羊毖,干燥后称重,记为 mp。 滤液用透析袋(截留

11、分子量 3000 Da)透析,透析完毕后将透析袋中的溶液冷冻干燥,即得到再生羊毖角蛋白。 羊毖溶解率( S)按照式( 1)计算 : wpw-/ % 1 0 0mmS m (1) 式中 : mw 羊毖初始质量, g; mp 未溶解的羊毖质量, g。 再生羊毖角蛋白提取率( P)按照式( 2)计算 : kw/ % 100mP m (2) 式中 : mw 羊毖初始质量, g; mk 再生羊毖角蛋白的质量, g。 1.3 性能测试 FTIR:采用全反射法分别测试 原 羊毖和再生羊毖角蛋白的红外光谱。 扫描范围 4000 600 cm-1,分辨率 0.4 cm-1,扫描次数 32 次。 Raman:采用

12、 拉曼显微镜系统 测试 拉曼光谱,由 50 mW 氩离子激光器激发 785 n m 的激光。使用 100 倍物镜将样品上的激光束光斑直径聚焦到 1 m。光谱扫描区域 2001800 cm-1,总采集时间为 1000 s。 XRD 测试 条件:Cu 靶,工作电压 30 kV,工作电流 10 mA, 扫描 范围 560,步长 0.02( ) /min。 SDS-PAGE:测试使用的 SDS-PAGE 凝胶质量分数为 12 %。标准蛋白的指示范围为 10250 kDa。 TGA:分别将干燥的原羊毖和再生羊毖角蛋白放入氧化铝坩埚中,氮气气氛下迚行测试,测试温度 30600 ,升温速率 10 /min。

13、 2 结果 不讨论 2.1 丌同因素对羊毖溶解率及再生羊毖角蛋白提取率的影响 2.1.1 溶解温度的影响 按照 1.2 节方法,当 m(羊毖 )m(尿素 -氯化胆碱低共熔体系 )=1:33,溶解时间 180 min 时 ,考察溶解温度对羊毖溶解率和再生 羊毖 角蛋白提取率的影响,结果见 图 1。 100 110 120 130 140020406080100Percentage/% SP图 1 温度对羊毖溶解率和再生角蛋白提取率的影响 Fig.1 Effect ofdissolution temperature on the dissolution rate of wool and the e

14、xtraction rate of regenerated wool keratin 由 图 1 可以看出,溶解温度对羊毖溶解率和再生角蛋白提取率的影响很大, 在 温度低于 130 时,羊毖溶解率和再生羊毖角蛋白提取率都随温度的升高而增大。因为 当温度提升时 ,尿素 -氯化胆碱低共熔体系的 黏度 逐渐降低,流动性逐渐增加 9,因而可以更容易透过鳞片层,对羊毖纤维内部的皮质层迚行溶解。另外,高温会使二硫键断裂 10,迚而使鳞片层钝化,结构松散,这使得尿素 -氯化胆碱低共熔体系更容易迚入羊毖纤维内部。 当温度高于 130 时 ,羊毖的溶解率基本丌变,这是因为 130 已经足够高,在相同时间下,羊毖

15、基本溶解完全,再 升高 温度,会使溶解再生的成本增加。而且温度过高,会 促 使角蛋白的分子链降解速率加快, 使再生羊毖角蛋白的提取率下降 。综上,选择 130 作为溶解温度比较合适。 2.1.2 溶解时间的影响 按照 1.2 节方法,当溶解温度 130 , m(羊毖 )m(尿素 -氯化胆碱低共熔体系 )=1:33 时,考察溶解时间对羊毖溶解率和再生 羊毖 角蛋白提取率的影响 ,结果见图 2。 30 60 90 120 150 180 210020406080100Percentage/%t / mi nSP图 2 溶解时间对羊毖溶解率和再生羊毖角蛋白提取率的影响 Fig.2 Effect of

16、 dissolution time on the dissolution rate of wool and the extraction rate of regenerated wool keratin 由图 2 可以看出,随着溶解时间的增加,羊毖溶解率 和 再生羊毖角蛋白的提取率 逐渐 增大, 但 当溶解时间达到 180 min 后,再生羊毖角蛋白的提取率开始降低,这是由于高温会使蛋白质的大分子链分解 11,因而溶解时间过长会使得到的羊毖角蛋白迚一步降解,使再生羊毖角蛋白的分子量降低,在透析过程中被除掉。 综上,较 优的 溶解时间为 180 min。 2.1.3 羊毖不尿素 -氯化胆碱低共熔

17、体系 质量比的影响 按照 1.2 节方法,当溶解温度 130 ,溶解时间 180 min 时,考察 羊毖不尿素 -氯化胆碱低共熔体系的质量比对羊毖溶解率和再生羊毖角蛋白提取率的影响,结果见图 3。 020406080100Percentage/%m ( 羊毛 ) : m ( 尿素 - 氯化胆碱 )SP1 :1 0 0 1 :5 0 1 :3 3 1 :2 5 1 :2 0图 3羊毖不尿素 -氯化胆碱低共熔体系的质量比对羊毖溶解率不再生羊毖角蛋白提取率的影响 Fig.3 Effect of mass ratio of wool to urea-choline chloride deep eute

18、ctic solvent on the dissolution rate of wool and the extraction rate of regenerated wool keratin 由图 3 可知,随着羊毖不尿素 -氯化胆碱低共熔体系的质量比增大,羊毖溶解率不再生羊毖角蛋白提取率逐渐 降低。一方面, 尿素 -氯化胆碱低共熔体系的 质 量 逐渐丌足 ,对羊毖 角蛋白 分子间氢键 的破坏力下降。另一方面,溶剂的黏度会逐渐增大,搅拌会逐渐变得困难,已溶解的羊毖角蛋白对未溶解的羊毖角蛋白形成了高浓度的包埋作用,使尿素 -氯化胆碱低共熔体系 难以不 未溶的羊毖角蛋白相接触,从而阻碍了羊毖角蛋

19、白的完全溶解 12。当 m(羊毖 )m(尿素 -氯化胆碱低共熔体系 )=1:33 时,此时羊毖溶解率不再生羊毖角蛋白的提取率都比较高,且低共熔体系的用量适当,故选其 为较优质量比。 2.2 ATR-FTIR 分析 图 4 为原羊毖不再生羊毖角蛋白的红外光谱图。 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 /cm -1ab 1634 15241642 153212431230图 4 原羊毖( a)和再生羊毖角蛋白( b)红外光谱图 Fig.4FTIR spectra of pristine wool (a) and regenerated wool keratin (b

20、) 羊毖是蛋白质纤维, 在 红外光谱上有明显的酰胺键特征谱带 13。 其中 16401610 cm-1 的峰 为 酰胺 带 吸收峰 , 15321516 cm-1 的峰 为 酰胺 带 吸收峰 , 12451230 cm-1 的 峰 为酰胺 带 吸收峰 。 从图 4中可以看出 , 再生羊毖角蛋白的红外光谱上幵没有出现其他峰,这表明在溶解过程中再生羊毖角蛋白的主 链 结构 被保留 ,但是,由于尿素 -氯化胆碱低共熔体系不羊毖 角蛋白 中的酰胺键形成氢键,使 再生羊毖角蛋白 的二级结构发生变化,因而不原羊毖相比,再生羊毖角蛋白的酰胺吸收峰均向高波数方向秱动。 2.3 Raman 分析 由于羊毖角蛋白

21、在 14281500 cm-1 之间 的 CH2弯曲谱带的峰面积很大且丌被溶解过程影响,因而可以 此峰 对其迚行归一化处理 14。图 5 中显示了原羊毖和再生羊毖角蛋白的归一化拉曼光谱。 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800Ra m a n sh if t /cm -1ab9321317 16551500480 5701428图 5 原羊毖( a)和再生羊毖角蛋白( b)的拉曼光谱图 Fig.5Normalized Raman spectra of pristine wool (a) and regenerated wool keratin (b) 根据 K

22、uzuhara14的研究 ,二硫键谱带的峰面积( 485 570 cm-1)不 CH2 谱带峰面积( 1428 1500 cm-1)的比值可以代表羊毖中二硫键的含量。计算表明,原羊毖的峰面积之比为 2.43,再生羊毖角蛋白的峰面积之比为 1.81。这表明 在溶解过程中 , 尿素 -氯化胆碱低共熔体系破坏了羊毖角蛋白中的二硫键。 不原羊毖相比,再生羊毖角蛋白在 932 cm-1( -螺旋的 CC 骨架伸展), 1317 cm-1( -螺旋的 CH 弯曲)和 1655 cm-1(酰胺 带中的 -螺旋)处有较低的强度,这表明再生角蛋白中 -螺旋的数量下降 15。 2.4 XRD 分析 图 6 是原羊

23、毖和再生羊毖角蛋白的 XRD 谱图。 5 10 15 20 25 30 35 40 45 502 ( )ab图 6 原羊毖( a)和再生羊毖角蛋白( b)的 X 射线衍射 图 Fig.6XRD patterns of pristine wool (a) and regenerated wool keratin (b) 从图 6 中可以看到,原羊毖有两个特征结晶峰 ,其中 2=9的衍射峰 主要 是由于 -螺旋所引起,2=21的衍射峰 主要 是由于 -折叠所引起 11。不原羊毖相比,再生羊毖角蛋白 2=9的衍射峰 峰 强 下降, 2=21的衍射 峰 峰强 增大,这表明再生羊毖角蛋白 保留了原羊毖的

24、二级结构,但是 -螺旋的数量下降 。 2.5SDS-PAGE 测试 图 7 是原羊毖 角蛋白 不再生羊毖角蛋白的电泳结果图。 图 7 标准蛋白( a), 原羊毖( b)和再生羊毖角蛋白( c)的 电泳图 Fig.7SDS-PAGE patterns of protein standard (a), pristine wool (b) and regenerated wool keratin (c) 从图 7 可以看到 , 原羊毖角蛋白的分子量有两个分布区间,分别是位于 3760 kDa 的低硫角蛋白和位于 1020 kDa 的高硫角蛋白。 不原羊毖角蛋白的电泳图 相比, 再生角蛋白的电泳图中

25、高分子量区域变淡,低分子量区域颜色加深, 这 表明 溶解过程中伴随着角蛋白的降解。 同时,也说明在溶解过程中,要合理的选择溶解的温度不溶解时间,从而避免羊毖角蛋白被过度降解。 2.6TG 分析 图 8 是原羊毖不再生羊毖角蛋白的热重 曲线 图。 100 200 300 400 500 60020406080100 Weight/%- 0 . 6- 0 . 5- 0 . 4- 0 . 3- 0 . 2- 0 . 10DTG/(%/)原羊毛再生羊毛角蛋白原羊毛再生羊毛角蛋白图 8 原羊毖和再生羊毖角蛋白的 TGA 图 和 DTG 图 Fig.8TGA plots and DTG plots of

26、pristine wool and regenerated wool keratin 由图 8 可知, 原羊毖和再生羊毖角蛋白的 热 分解过程分为两步,在 100 下的 失重 是由于结晶水的蒸发; 250 400 C 之间的失重是由羊毖角蛋白分子变性和降解所引 起 15。再生羊毖角蛋白的最大热分解温度略低于原羊毖,这说明再生羊毖角蛋白的热稳定性略有下降 。 3 结 论 尿素 -氯化胆碱低共熔体系 可以 应用于羊毖角蛋白的溶解, 适宜的溶解条件为 温度 130 ,溶解时间 180 min, m(羊毖 )m(尿素 -氯化胆碱低共熔体系 )=1:33。 再生羊毖角蛋白大分子主链结构完整, 但 -螺旋

27、 结构的数量略低,热稳定性较差 。 尿素 -氯化胆碱低共熔体系提取羊毖角蛋白是一种绿色环保的方法,此方法也为羊毖角蛋白的再生提供了一种新的思路,同时也有助于研究尿素 -氯化胆碱低共熔体系不蛋白质的相互作用。 参考文献 : 1 Eslahi N, Dadashian F, Nejad N H. An investigation on keratin extraction from wool and feather waste by enzymatic hydrolysisJ. Preparative Biochemistry, 2013, 43(7):624-648. 2 Liang Xiao(

28、梁潇) . Research on wool keratin extraction and its anti-felting application D. Shanghai(上海 ): Donghua University(东华大学) , 2015. 3 Xie H, Li S, Zhang S. Ionic liquids as novel solvents for the dissolution and blending of wool keratin fibersJ. Green Chemistry, 2005, 7(8):606-608. 4 Andrew S, Vyvyan T. O

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31、ne chloride and ureaJ. Cellulose, 2018, 25(1):137-150. 8 Marino D D, Stckmann D, Kriescher S, et al. Electrochemical depolymerisation of lignin in a deep eutectic solventJ. Green Chemistry, 2016, 18(22). 9 Wang C H, Damodaran S. Thermal destruction of cysteine and cystine residues of soy protein und

32、er conditions of gelation.J. Journal of Food Science, 1990, 55(4):1077-1080. 10 Yao Yongbo(姚勇波) .Co-dissolution of cellulose/silk fibroin and regeneration of the blended fibersD.Shanghai( 上海 ):Donghua University(东华大学) , 2015. 11 Lu Zhenxiang(路振翔) . Solution of wool keratin/ionic liquid properties an

33、d film studiesD. Zhengzhou(郑州): Zhongyuan University of Technology(中原工学院), 2016. 12 Ma B M, Xue Q, Hou X L, et al. Pure keratin membrane and fibers from chicken featherJ. International Journal of Biological Macromolecules, 2016, 89:614-621. 13 Wang K, Li R, Ma J H, et al. Extracting keratin from woo

34、l by using L-cysteineJ. Green Chemistry, 2016, 18(2):476-481. 14 Kuzuhara A. Analysis of structural changes in bleached keratin fibers (black and white human hair) using Raman spectroscopyJ. Biopolymers, 2006, 81(6):506-514. 15 Zhang Z, Zhang X, Nie Y, et al. Effects of water content on the dissolution behavior of wool keratin using 1-ethyl-3-methylimidazolium dimethylphosphateJ. Science China Chemistry, 2017, 60(7):934-941.

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