姜黄素对泡沫细胞形成的影响及机制.DOC

1、作者简介 ：刘承，男，硕士研究生，研究方向：动脉 粥样硬化的发病机制与防治 。 E-mail： 。 手机号码：15228284395。 通 信 作者：钟毅，男，硕士，主治医师，研究方向：动脉粥样硬化的发病机制与防治 。 E-mail：。 手机号码： 18283097928。 基金项目 ：国家自然科学基金资助项目（ 31300946）；泸州市 -泸州医学院合作科技项目（ 2013LZLY-J53）。 姜黄素 对 泡沫细胞形成的 影响及机制 刘承，李家富， 冯健， 钟毅 （泸州医学院 附属医院心内科 ，四川 泸州 646000） 摘要：目的 研究 姜黄素对氧化型低密度脂蛋白 （ oxidized

2、low density lipoprotein,ox-LDL） 诱导的人单核巨噬细胞源性泡沫细胞形成的影响 及 其可能的机制 。 方法 采用体外培养的 人单核细胞白血病细胞 （ human acute monocytic leukemia cell line,THP-1） 作为研究对象，由 佛波酯（ Phorbol-12-myristate-13-acetate， PMA） 刺激 人单核细胞为巨噬细胞，再加 入ox-LDL（ 50 gmL-1） 诱导复制 形成 泡沫细胞模型。 实验分为空白对照组，模型组，姜黄素组， Toll样受体 （ Toll-like receptor,TLR） 4 抗体

3、组，姜黄素 + TLR4抗体 组， TLR4 同源非特异性抗体组。采用 油红 O 染色观察细胞形态； 实时荧光定 量 PCR和蛋白印迹法检测 TLR4 的表达；酶法测定细胞内总胆固醇 （ total cholesterol， TC） 、 游离胆固醇（ free cholesterol， FC）、 胆固醇酯（ cholesterol ester,CE）和甘油三酯（ triglyceride， TG） 。 结果 与空白对照组 比较 ，模型组 TLR4 mRNA和蛋白 表达显著增加 (P 0.05)，而姜黄素组 的表达明显降低 (P 0.05)， 同时ox-LDL刺激 使 巨噬细胞胞内红染颗粒 显著

4、 增多， 且 细胞大量聚集；与模型组 比较 ： 姜黄素组， TLR4 抗体组，姜黄素 + TLR4 抗体组胞内红染颗粒显著减少，细胞的聚集减轻，明显降低胞内 TC、 FC、 CE和 TG 的含量 (P 0.05)；而 TLR4同源非特异性抗体组 却没有显著差别 (P 0.05)。 结论 姜黄素通过 抑制 TLR4 表达， 降低 胞内脂质的含量， 减少 人单核 巨噬细胞源性泡沫细胞的形成。 关键字： 姜黄素 ;Toll样受体 4;氧化型低密度脂蛋白 ;泡沫细胞 Effect and Related Mechanism of Curcumin on the Formation of Foam Ce

5、lls Cheng Liu, Jiafu Li,Jian Feng, Yi Zhong(Department of Cardiology, Affiliated Hospital of Luzhou Medical College, Luzhou,Sichuan 646000,China) ABSTRACT: Objective To explore the effect of Curcumin on the formation of foam cells induced by the Oxidized low density lipoprotein(ox-LDL) and analyze t

6、he related possible mechanisms. Method As the research object, THP-1 was incubated with PMA(160 nmolL-1) to differentiate into macrophages, then the macrophages were added with ox-LDL(50 ugmL-1) to induce the formation of replication foam cell model. Six experimental groups were included, they were

7、blank control group, model group, curcumin group, TLR4 antibody group, curcumin +TLR4 antibody group and TLR4 isotype control antibody group. The cell morphology was examined by Oil red staining. The expression of TLR4 was assessed buy Western Blot and Real-Time qPCR. Intracellular contents of TC, F

8、C, CE and TG were detected through enzymatic assays. Results Compared with the blank control, the expression of TLR4 significantly increased with ox-LD added(P 0.05), but the expression decreased with curcumin added(P 0.05). Additionally， intracellular red particles of macrophages and cell clusters

9、also increased with ox-LDL added;In comparison with model group, cells from curcumin group, TLR4 antibody group and curcumin +TLR4 antibody group aggregated less, and intracellular red particles decreased sharply as well as the content of TC, FC, CE and TG(P 0.05), however there was no obvious diffe

10、rence between model group and TLR4 isotype control antibodies group(P 0.05). Conclusion curcumin inhibits cholesterol accumulation in macrophages and the formation of foam cells by regulating the expression of TLR4. KEY WORDS: Curcumin; Toll like receptor 4; oxidized low density lipoprotein; foam ce

11、lls 动脉粥样硬化 （ atherosclerosis， AS） 通常被认为是冠心病最主要的原因，其 发生发展与炎症反应 、 细胞增殖和脂质积累等 紧密 相关 1。大量研究证实 2-4，脂质在巨噬细 胞中集聚形成泡沫细胞的过程是 AS 发生发展的重要环节和典型病理特征，该过程的主要特征是细胞外修饰性低密度脂蛋白（ low density lipoprotein， LDL）的摄入和细胞内胆固醇流出之间的失衡 。因此抑制脂质的积累，增加胆固醇的逆转运，减少泡沫细胞的形成， 延缓 粥样斑块的进展，可能成为防治 AS 的突破点。 TLRs 是一类单个跨膜非催化性蛋白， 广泛存在于血管内皮细胞、巨噬细

12、胞表面，是感应病原体和传递细胞外抗体识别信息到胞内的首个受体，参与启动细胞内信号转导 以及 激活内含子、编码协同刺激分子等多种基因 5， 能识别病原体相关分子模式 (Pathogen-associated molecular patterns， PAMPs)、损伤相关分子模式（ damage-associated molecular pattern， DAMPs） 和 内源性配体，是参与天然免疫和特异性免疫的重要受体 6。 研究 证实 3， TLR4 作为巨噬细胞表面的模式识别受体 (pattern recognition receptor， PRR)，在 AS 发生发展中发挥重要作用 。 Z

13、 Lu等 7发 现 TLR4 高度表达 于 人和小鼠富含脂质的动脉粥样斑块中，而在 TLR4 基因缺陷小鼠体内，动脉粥样斑块中的脂质 含量 则明显降低 ； Bjorkbacka 等 8发现在髓样分化因子 (myeloid differentiation factor88, MyD88)缺陷的小鼠体内巨噬细胞集聚和动脉硬化病变 有所 减轻，不久后 Saxena.5等也 报道 ，在 TLR2 和 TLR4基因缺陷小鼠体内粥样硬化斑块面积减少约 50%， 并且 TLR2 和 TLR4 在粥样斑块中的表达伴随 着 p65 核因子 B (nuclear factor-kappa B,NF-B)在病变内皮

14、细胞和巨噬细胞中的核转位。 另 外 ， 作为 TLR4 的内源性配体， 修饰性低密度脂蛋白分子，如 ox-LDL 和轻度修饰低密度脂蛋白（ minimally modified LDL， mmLDL）都是促进 AS 的修饰性自身抗原， 最近， Janeesh 等 9的实验表明 ox-LDL 可 激活TLR4，向细胞内传递信号并激活核转录因子 NF-B进一步诱导靶基因表达，触发 单核细胞趋化蛋白 -1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)、肿瘤坏死因子 （ tumor necrosis factor， TNF-)、白细胞介素 6（ interleukin，

15、IL-6）、血管细胞黏 附分子 1(vascular cell adhesion molecule 1,VCAM-1)等释放， 触发炎症反应和泡沫细胞的形成。由于 TLRs 参与的泡沫细胞分化和形成的分子机制错综复杂，目前还未被完全阐明。 姜黄素是植物姜黄中最主要的活性物质， 具有抗炎、抗氧化、抗凝、抗血小板聚集以及调酯、降血压、保护血管内皮等作用 10。而 AS 是与炎症 反应 ， 氧化应激、 血脂异常等紧密相关的疾 病，大量研究都已证实姜黄素有抗 AS 的作用10-12，尤其是在胆固醇平衡调节方面 13。研究 表明 1：姜黄素 通过依靠 泛素蛋白酶体系统（ ubiquitin-protea

16、some system, UPS）降解清道夫受体 A(scavenger receptor A,SR-A)蛋白， 抑制 脂质的摄入， 同时 又通过 调控 过氧化物酶体增殖物激活受体 (peroxisome proliferator activated receptor, PPAR)/肝 X 受体 （ liver X receptor ,LXR ），增加 ATP 结合盒转运蛋白 A1、 G1(ATP-binding cassette transporterA1、 G1,ABCA1、 G1)以及 SR-BI 的转录和翻译，促进胆固醇的流出。另外， 最近 Meng 等 11发现 姜黄素能通过抑制 T

17、LR4 介导的 NF-B/丝裂原活化蛋白激酶（ mitogen-activated protein kinase,MAPK） 信号通路，减轻由脂多糖（ lipopolysaccharide， LPS）诱导的炎症反应、氧化应激。 因此，本实验拟以人单核细胞源性巨噬细胞作为研究的对象，观察姜黄素对ox-LDL 诱导 的 泡沫细胞形成的影响，并对其机制做进一步探讨。 1 材料与方法 1.1 细胞株 THP-1， 美国菌种保藏中心（ American Type Culture Collection，ATCC） 。 1.2 药物 与试剂 姜黄素、 PMA、油红 O 均为 美国 Sigma 公司 产品 ，

18、批号分别为： 78246、 P1585、 FS002030； RPMI-1640 培养基 ， 美国 Gibco 公司 ，批号：11875093； 胎牛血清 (fetal bovine serum,FBS)， 美国 Hyclone 公司 ，批号：sv30087.02；人 ox-LDL， 广州奕源生物科技有限公司 ，批号： YB-002；细胞计数试剂盒（ Cell Counting Kit-8， CCK-8） ， 日本 DOJINDO 公司 ，批号： CK-04；苏木素 染色液，北京赛驰公司，批号： 070007-H3；多聚甲醛 、 RIPA 裂解液、BCA 蛋白浓度测试试剂盒、 SDS-PAGE

19、 凝胶制备试剂盒、脱脂奶粉、 TBS 均为武汉阿斯本公司 产品 ，批号 分别为 ： AS1018 、 AS1004、 AS1086、 AS1012、 AS1033、AS1024； TLR4 抗体、 TLR4 同源非特异性抗体、 甘油醛 -3-磷酸脱氢酶（ glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH） 抗体 均 为 英国 Abcam 公司产品 ,批号分别为： ab13867、 ab37416、 ab37168； 辣根过氧化物酶（ horseradishperioxidase， HRP）标记的羊抗鼠二抗 ， 美国 KPL 公司，批号：074-15

20、06； 0.45m PVDF 膜，美国 Millipore 公司 ,批号： IPVH00010； Trizol 试剂盒 ， 美国 Invitrogen 公司 ，批号： 15596-026； 实时计量 PCR 逆转录试剂盒 ， 日本 TOYOBO 公司 ，批号： FSK-100； 实时计量 PCR 测定试剂盒 SYBR Premix Ex Taq， 日本 TaKaRa 公司 ，批号： RR420A， TC、 TG 测定试剂盒 均为 南京建成生物工程研究所 产品 ， 批号分别为： A111-1、 A110-1， 其余试剂均为国产或进口分析纯。 1.3 仪器 Cytomat 10 C 细胞培养箱 、

21、 TSE400D 超低温冰箱、 Multiskan GO 全波长 酶标仪、 Multifuge X3 台式超速离心机、 Micro CL 冷冻离心机、 9700PCR 仪均为 美国 Thermo Fisher 公司 产品 ； HH-4 型 恒温水浴锅，江南仪器厂； sw-cj-2f 型超净工作台，苏州净化公司； 倒置生物显微镜 、 TS100-F 倒置显微镜均为 日本Nikon 公司 产品 ； DYCP-36 型 电泳仪，北京六一仪器厂。 1.4 THP-1 细胞的培养 和 泡沫细胞模型 复制 将含有 10%FBS、 1%青链霉素的RPMI 1640 培养 液作为 THP-1 细胞完全培养基

22、， 细胞在 37 ， 5%CO2 培养箱 中培养 ，每 2d 换液 一 次 ， 45d 即可传代。 如文献所述 14， 取 处于 对数生长期细胞，用 含 160 nmolL-1PMA 的完全培养基诱导培养 48h，得到 THP-1 源性巨噬细胞。将所得细胞更换成含 50 gmL-1 的 ox-LDL 无血清 RPMI 1640 培养液， 培养箱中共同孵育 48h， 胞内 CE/TC50%即可认为 泡 沫 细胞模型 复制成功 15。 1.5 细胞活性检测 将对数生长期 THP-1 细胞与含 160 nmolL-1 PMA 的完全培养基配制成浓度为 每毫升 1105 个 的细胞悬液，按 每孔 10

23、4 个 细胞接种于 96 孔板，置于培养箱中培养 48h后 贴壁，按 CCK-8 试剂盒说明 书 操作，加入不同浓度 （ 080 molL-1） 姜黄素处理 24h 后， 用 酶标仪测定 490 nm波长下的光吸收值 作为判定细胞活性的指标 。 1.6 油红 O 染色和泡沫细胞形成率测定 用预先置入 无菌 盖玻片的 6 孔培养板培养细胞，按照不同分组处理细胞后，用 PBS 冲洗盖玻片 3 次，每次 5min， 4%多聚甲醛固定 30min，油红 O 染色 10min，苏木素复染 5min，分色返蓝后甘油封片。显微镜下观察， 按文献所述 16： 胞内较大红染颗粒 5个即可判定为泡沫细胞，镜下随机

24、观察 10 个视野，计算泡沫细胞数和细胞总数，泡沫细胞形成率 =泡沫细胞数 /细胞总数 100%。 1.7 蛋白质免疫印迹法（ Western Blot） 离心收集细胞，加入 RIPA 裂解液提取总蛋白，使用 BCA 蛋白质浓度测定试剂盒测定样品蛋白浓度。 SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白，每孔上样量 40g，按浓缩胶 80V、分离胶 120V 进行恒压电泳，切去相应胶带 300mA 恒流转印至 PVDF 膜；置于 5%脱脂牛奶室温封闭 1h，除去封闭液后加入 TLR4（ 1 500）或内参照 GAPDH 一抗（ 1 10000） 4 过夜，TBST 洗膜 3 次，每次 10min；加入 H

25、RP 标记的山羊抗鼠（ 1 10000）室温 1.5h，TBST 洗膜 3 次，每次 10min 后，采用化学发光法定影显色，用 Image Lab 软件将各组 TLR4 光密度值分别与内参 GAPDH光密度值分析比较，其比值代表 TLR4蛋白水平。 1.8 实时荧光定量聚合酶链反应 (Real-Time qPCR) 按照 Trizol试剂盒说明书提取细胞总 RNA，按逆转录试剂盒操作获取 cDNA；使用 RT-qPCR 试剂盒测定mRNA 量。 TLR4 引物序列：上游 5-GGATGAGGACTGGGTAAGGAAT-3，下游 5-AATGAAGATGATACCAGCACGAC-3，引物长

26、度 259bp。内参照 GAPDH引物序列上游 5-GGTCGGAGTCAACGGATTTG-3，下游5-GGAAGATGGTGATGGGATTTC-3，引物长度 218bp。反应条件：预变性95 1min，变性 95 15s，退火 58 ， 20s，延展 72 20s，共 40 个循环。用 Ct来计算基因的表达水平， 具体 公式如下： Ct=目的基因 Ct 值 GAPDH 基因 Ct值； Ct=实验组 Ct对照组 Ct；实验组基因相对表达量 =2 Ct。 1.9 细胞内 TC、 FC、 CE 及 TG 的测定 将待测细胞制成悬液后 1000 rmin-1离心 10min，弃上 清液，收集细胞

27、样本，冰浴条件条件下超声波破碎细胞获得匀浆液。按照 TC 测定试剂盒说明书 测定 TC， 按 测定 TC 方法但不添加胆固醇酯酶即可测定 FC， TC 与 FC 之差即为 CE 含量。用相同的方法，按照 TG 测定试剂盒说明书测定胞内 TG 含量。 1.10 统计学处理 方法 使用 SPSS 17.0、 GraphPad Prism 5 软件进行统计分析和作图。计量资料均 以均数 标准差 （ xs） 表示， 采用方差分析， 处理组之间的比较采用 SNK-q 法检验 、 处理组与空白组比较采用 Dunnett-t 法检验。以双侧检验、 P 0.05 为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 姜黄素

28、的毒性 检测 为了排除姜黄素的直接毒性作用对实验结果的干扰，我们用不同浓度 (080 molL-1)的姜黄素与人单核细胞源性巨噬细胞共同孵育48h，然后用 CCK-8 法测定细胞活力。结果表明：当姜黄素浓度小于 40 molL-1时，其对巨噬细胞的毒性作用 无统计学 意义 (P 0.05)；而当浓度增大到 80 molL-1 时，姜黄素则对巨噬细胞产生明显的毒性作用 ，有统计学意义 (P 0.05)，结果见图 1。 2.2 姜黄素对 THP-1 源性泡沫细胞形成的影响 油红 O 染色后， 在 400 倍 显微镜下观察 发现：与 空白组 （ 图 2.A） 比较，模型组 （ 图 2.B）细胞 胞内

29、 出现 大片橘红色颗粒， 而用姜黄素 (040 molL-1)预 处理 组（ 图 2.CF） 的巨噬细胞，胞内橘红色颗粒数量显著减少。 另外，在 200 倍光镜下可见模型组 （ 图 2.b） 中泡沫细胞聚集成团，而 40 molL-1 姜黄素组 （ 图 2.f） 泡沫细胞 则 未出现此现象。 计算泡沫细胞形成率后发现：与空白组 比较 ，模型组泡沫细胞形成率明显增加，差别有统计学意义 (P 0.05)； 而与模型组 比较 ，不同浓度的姜黄素 均能 明显减少泡沫细胞形成率 ， 并且浓度越高，作用越强， 差别有 统计学 意义 (P 0.05),与在显微镜下观察结果一致，结果见图 2。 图 1 姜 黄

30、素对细胞活性的影响 (xs ,n=3） Fig. 1 Effect of curcumin on cell viability 注： 与空白组比较 ， *p 0.05。 2.3 姜黄素对 TLR4 的影响 检测 TLR4 mRNA和蛋白 含量发现： 与空白组比较，模型组中 ox-LDL 能诱导 TLR4 mRNA 和蛋白含量显著增加 ，差别有统计学意义（ P 0.05）；与模型组比较， 姜黄素预处理组中 TLR4 mRNA 和蛋白含量 均 比模型组低， 并且随着姜黄素的浓度增加，差异越显著， 差别有 统计学 意义（ P0.05） ，结果见图 3。 图 2 姜黄素对泡沫细胞形 成的影响 (xs,

31、n =3) Fig 2 Effect of curcumin on the formation of foam cells 注： A.空白组； B.模型组； C.5 molL-1 姜黄素组； D.10 molL-1 姜黄素组； E.20 molL-1 姜黄素组 F.40 molL-1 姜黄素组（光镜 400 倍放大）。 注：与空白组比较， *P 0.05；与模型组比较， *P 0.05；与 5 molL-1姜黄素比较， #P 0.05；与 10 molL-1 姜黄素比较， #P 0.05；与 20 molL-1 姜黄素比较， P 0.05。 Um 注： a.空白组； b.模型组： f.40 m

32、ol L-1 姜黄素组（光镜 200 倍放大） 。 2.4 姜黄素 和 TLR4 抗体 对 THP-1 源性泡沫细胞形成 和脂质积累 的影响 2.4.1 姜黄素和 TLR4 抗体 对泡沫细胞形成的影响 油红 O 染色后观察结果：与空白组 （图 4.A） 比较，模型组 （图 4.B） 胞内颗粒明显增加； 与模型组比较 ，TLR4 抗体 组 、姜黄素组、 TLR4 抗体 +姜黄素组 的巨噬细胞胞内红染颗粒显著下降（ 图 4.C、 E、 F），而 TLR4 同源非特异性抗体组的巨噬细胞内红染颗粒数量则未见明显变化 （图 4.D） 。 计算泡沫细胞形成率后发现：与空白组 比较 ，模型组泡 沫细胞形成率

33、明显增加 ， 差别有统计学意义（ P 0.05）； 与模型组 比较 ，TLR4 抗体组 、姜黄素组、 TLR4 抗体 +姜黄素组的 泡沫细胞形成率 显著 下降， 差别有 统计学 意义（ P 0.05） ,而 TLR4 同源非特异性组泡沫细胞形成率与模型组比较 无明显差异， 无统计学意义（ P 0.05）， 与 之前 显微镜下观察结果一致 ，结果见图 4。 注： A.空白组； B.模型组； C.TLR4 抗体组； D.TLR4 同源非特异性抗体组； E.姜黄素组； F.姜黄素 +TLR4 抗体组（光镜 400 倍放大）。 注：与空白组比较， *P 0.05；与模型组比较， * P 0.05；与

34、TLR4抗体组比较， # P 0.05；与姜黄素组比较， P 0.05。 图 4 姜黄素和 TLR4 影响泡沫细胞的形成 (xs ， n=3) Fig. 4 Effect of curcumin and TLR4 on the formation of foam cells 图 3 姜黄素影响 TLR4mRNA 和蛋白表达水平检测结果（ xs ， n=3） Fig 3 Effect of curcumin on TLR4mRNA and protein expression levels 注： *P 0.05，与空白组比较； *P 0.05 与模型组比较； #P 0.05 与 5 molL -

35、1 姜黄素比较； #P 0.05 与 10 molL-1 姜黄素比较； P 0.05 与 20 molL-1 姜黄素比较。 2.4.2 姜黄素和 TLR4 抗体 对细胞脂质的影 响 酶法检测脂质含量：与空白组比较，模型组中 TC、 CE/TC、 TG 均高达 18.78 mmolg-1， 65.09%和 20.29 mmolg-1，泡沫模型复制成功；与模型组比较， TLR4 抗体组、姜黄素组、 TLR4 抗体 +姜黄素组胞内 TC、 FC、 CE 以及 TG 含量均显著下降，差别有统计学意义（ P 0.05），而 TLR4 同源非特异性抗体组 FC、 CE、 TG 含量变化不明显，无统计学意义

36、（ P 0.05） ，结果见表 1，图 5。 3 讨论 AS 性疾病 是最常见的心血管疾病，同 时 也 是心脏病发作和中风最主要的原因，其死亡率已超过肿瘤，成为目前全球死亡率最高的疾病 4。巨噬细胞来源于单核细胞，属于天然免疫细胞， 能 参与 介导 很多慢性炎症， 如 AS、慢性阻塞性肺疾病等 。众所周知， ox-LDL 通过对 血管平滑肌细胞 的毒性、诱导炎症基因的表达等方式参与 AS 的发生发展过程 ，因此血浆中高水平 ox-LDL 还被认为是 AS的危险因素。研究发现 13， 17，巨噬细胞不受调控的摄入 ox-LDL 以及过量的胆固醇酯化和受损胆固醇的释放均导致胆固醇酯在胞内不断积聚成

37、脂滴，最终触发泡沫细胞的形成 ， 促进 AS 的发生发展 。虽然许多发现都证实了 TLR4 参与 AS 的发生发展过程，而关于 ox-LDL 对 TLR4 的作用具体机制以及 TLR4 和泡沫细胞形成之间的关系还需进一步探明。 自古以来，姜黄就作为一种有效的中草药治疗各种疾病 ， 现代医学证实，姜黄素通过调节不同的信号分子产生各种药理作用。 D Coban 等 12发现 姜黄素 一方面 通过调节 p38MAPK 和 NF-B信号通路抑制 MCP-1 表达，调节炎症反应； 另一方面通过上调核因子 E2 相关因子 2（ nuclear erythroid-related factor 2， Nrf

38、2)抑制 CD36 过表达， 从而 发挥抗 AS 作用 。 最近的研究 1， 13， 18表明 ，姜黄素能够有效降低胆固醇在巨噬细胞中的积累， 抑制 AS 发生发展 。 TLR4 被认为是巨噬细胞向泡沫细胞分化的必要受体，但目前关于姜黄素和 TLR4 以及泡沫细胞之间的关系尚未见报道。因此我们推测姜黄素是否能够通过 TLR4 抑制由 ox-LDL 诱导的泡沫细胞的形成，减轻粥样硬化斑块病变，进一步补充姜黄素抗 AS 的分子机制。 图 5 姜黄素和 TLR4 抗体对 TG 含量的影响 （ xs ， n=3） Fig 5 Effect of curcumin and TLR4 antibody o

39、n intracellular TG content 注：与空白组比较， *p 0.05；与模型组比较， *p 0.05；与 TLR4 抗体组比较， #p 0.05；与姜黄素组比较， p 0.05。 表 1 姜黄素和 TLR4 抗体 对胆固醇含量的影响（ xs ， n=3） Table 1 Effect of curcumin and TLR4 on the contents of TC, FC and CE in cells 组别 TC/mmolg-1 FC/mmolg-1 CE/mmolg-1 CE:TC/% 对照组 5.640.15 3.560.16 2.080.06 36.831.41

40、 模型组 18.780.18* 6.550.18* 12.220.36* 65.091.30* TLR4 抗体组 13.210.37* 6.060.20* 7.150.34* 54.101.51* TLR4 非特异性抗体组 18.130.11* 6.460.24 11.670.33* 64.381.48 姜黄素组 11.970.07* 5.940.17* 6.020.21* 50.331.53* 姜黄素 +TLR4 抗体 8.970.24# 5.480.16# 3.490.19# 38.911.48# 注：与空白组比较， *p 0.05；与模型组比较， *p 0.05；与 TLR4 抗体组比较

41、， #p 0.05；与姜黄素组比较， p 0.05。 在本实验中，我们发现姜黄素能减轻 THP-1 巨噬细胞 脂质 的蓄积，减少泡沫细胞的形成。实验中，我们首先测定了姜黄素对 THP-1 巨噬细胞的毒性作用，排除了由于姜黄素的毒性 作用 对实验结果产生的 影响 。其后，我们观察到 ox-LDL能明显增加胞内红染颗粒 数量 ，促进泡沫细胞的形成，刺激细胞聚集成团（ 图2.b 箭头示 ），而在加入不同安全浓度范围内 (040 molL-1)的姜黄素后能显著减轻脂质在巨噬细胞中的沉积，并且姜黄素的浓 越高，巨噬细胞中橘红色颗粒越少，细胞之间的聚集程度也逐渐减轻。 目前 的观点认为 巨噬细胞的聚集可能

42、也参与了泡沫细细胞的形成过程 19， 巨噬 细胞表面的 TLR4 在外界刺激下促进微粒释放，而巨噬细胞通过这些释放的微粒 进行 细胞之间的交流 20。虽然 Higashimori等 21已在 ApoE 基因缺陷小鼠主动脉病变区观察到泡沫细胞的集聚，但在 体外培养的 细胞 实验中 可能还尚未见类似报道 。 为 了探究 TLR4 在泡沫细胞形成中的作用，我们分别用 TLR4 抗体 (10 gmL-1)或 TLR4 同源非特异性抗体 (10 gmL-1)预处理 THP-1 巨噬细胞 1h，此后再 同时 加入 50 gmL-1 的 ox-LDL 共孵育 48h， 400 倍光镜下 观察发现 TLR4抗

43、体组的细胞胞质红染颗粒明显比模型组少，泡沫细胞形成率低，细胞脂质含量也明显下降，而 TLR4 非特异性抗体组与模型组之间的差别却不显著，这表明TLR4 介导了 ox-LDL 促进泡沫细胞的形成过程。为进一步研究姜黄素是否通过TLR4 介导减轻泡沫细胞形成，我们用 不同浓度 (040 molL-1)姜黄素预处理THP-1 巨噬细胞 1h 后与 50 gmL-1 的 ox-LDL 共孵育 48h，检测发现 TLR4 的mRNA 和蛋白量明显低于不用姜黄素预处理组， 并且随着姜黄素的浓度增加，差异越显著， 这 表明 ox-LDL 能促进 TLR4 mRNA 和蛋白表达 ,而姜黄素能明显抑制 TLR4

44、 基因的转录和翻译。此外，我们分别用 TLR4 抗体 (10 gmL-1)和等量不含血清的培养基预处理巨噬细胞 1h， 再 加入姜黄素 (40 molL-1)，最 后与 ox-LDL共 同 孵育 48h，显微镜下观察发现 ： 相对于模型组来说， 这两组胞内红染颗粒的含量 都有所下降，并且 TLR4 抗体和姜黄素协同处理的巨噬细胞组的效果更加明显，泡沫细胞形成率更低。 最后，为更加深入阐明姜黄素和 TLR4 对泡沫细胞形成的影响，我们检测了胞内脂质含量包括 TC、 FC、 CE 以及 TG。结果发现 （ 表 .1，图 .5）： 空白对照组 细胞 CE 只占 TC 的 36.83%1.41%，而模

45、型组胞内 CE/TC高达 65.09%1.30%， 符合 泡沫细胞的标准 15，但当加入姜黄素或 TLR4 抗体后胞内 TC 和 TG 都显著减少， 模型组 TC 含量 18.780.18 mmolg-1，加入姜黄素后 TC 含量降低为 11.970.07 mmolg-1， 并且姜黄素和 TLR4 抗体的协同作用使效果更显著 ， TC 含量仅 8.970.24 mmolg-1。以上结果表明姜黄素可能通过 抑制TLR4 而减轻 ox-LDL 诱导的 THP-1 源性泡 沫细胞的形成和脂质积蓄。 该实验中，仍然存在一些不足。首先，我们检测泡沫细胞胞内脂质含量时发现，与模型组 比较 ， TLR4 同

46、源非特异性抗体虽不能明显降低脂质含量，但其胞内 TC 和 CE 却与模型组有 统计学 差别 (P 0.05)，得到这种结果可能 是 因为我们将重点只放在了泡沫细胞形成的中枢信号通路 TLR4 上，而忽略了 TLR2、 TLR7、TLR9 等其他 TLRs，但这些 TLRs 也曾被证实参与了巨噬细胞摄取脂质的过程 22，23，因此，不得不承认在 ox-LDL 的 刺激下其他 TLRs 也可能导致了泡沫细胞的形成 ， 对实验结果产生影响。其次，我们不清楚该实验中 ox-LDL 诱导后 的泡沫细胞 活性， 某些 观点 24认为泡沫细胞聚集可能是巨噬细胞死亡的表现之一 ， 但 我们并未采取任何方法评价

47、其活性，也未判断细胞表面的受体是否受损，从而可能对实验结果产生影响。最后，关于姜黄素通过 TLR4 而激活细胞内信号通路 以 及所 产生作用也未 完全 在实验中探明，需要在以后的研究中进一步 揭示 。 本实验的结果再次证实了姜黄素能减轻 THP-1 源性泡沫细胞的形成以及脂质在胞内的积累，也验证了 TLR4 在 ox-LDL 诱导 THP-1 巨噬细胞源性泡沫细胞形成过程中的关键作用，同时提出一个新的分子机制：姜黄素通过抑制 TLR4 参与调控泡沫细胞 的形成。目前，还尚未发现对此机制的报道， 因此我们的发现可能有助于更透彻理解 TLR4 在 AS 发病机制和病理进展中的作用 ， 同时 为姜黄

48、素抗 AS 作用提供理论支持， 推 进 姜黄素在 临床 治疗中的 应用 。 参考文献 : 1 Zhao J F,Ching L C,Huang Y C ， et al,. Molecular mechanism of curcumin on the suppression of cholesterol accumulation in macrophage foam cells and atherosclerosisJ. Molecular nutrition international journal of clinical chemistry, 2013, 424: 245-252. 14 Zhao G J,Tang S L,Lv Y C ， et al,. Antagonism of betulinic acid on LPS-mediated inhibition of ABCA1 and cholesterol efflux through inhibiting nuclear factor-kappa