川贝母基础物质研究模式的探讨.docx

1、川贝母基础物质研究模式的探讨【摘要】 本文主要探讨川贝母的主要基源种的基础物质的研究模式。通过分析与论证阐述了川贝母物质基础的研究路线及可行性。具体步骤是首先测定其有效成分及各种生物碱的含量，进而分离及纯化其有效成分，同时通过其化学组分分析，阐述其有效成分及各种生物碱的药理活性。川贝母物质基础的研究这对于合理利用和开发川贝母植物资源及其质量控制具有重要意义。 下载 【关键词】 川贝母 物质基础 皂苷 生物碱 提取 分离 药理作用 前 言 中药与天然药物的药效物质（有效成分）研究是中药现代化的关键之一。中药和天然药物的药效物质研究与中药现代化有着密切关系，对中药创新药物的研制开发，对中药炮制理论

2、的阐明，对中药制剂现代化的发展，对中药药品的质量控制，均会起到较大的促进作用。本文就中药川贝母基础物质的研究项目进行论证，为川贝母的药物开发和质量管理控制提供了切实可行的技术方法和手段，也为地道中药川贝母的现代化发展奠定了一定的理论基础。 第一章 川贝母简介及其基础物质研究的重要性 1.1、川贝母的简介 1.2、药用川贝母的栽培 川贝母对气候土壤要求不严，山地、平原均可种植、耐寒，全国各地都适宜栽培，川贝母喜冷凉湿润气候、耐寒，宜选土层深厚，水分充足，排水良好、疏松，富含腐植物的砂质土壤栽培。一、种子繁殖：6-7 月种子采收后立即播种、穴播、开浅穴、将种子 1-2 颗放入穴内，覆细土，第二年春

3、季出苗，幼苗出现真叶时，可除草问苗。二、鳞茎繁殖：春季地解冻后，翻耕、做畦，然后于畦内施用腐熟的厩肥。畦整好后，于 4-6 月栽种，把小鳞放于穴内。覆土、压实。生长期间要除草、灌水。追肥 2 次，主要施厩肥或堆肥。病害有锈病、灰霉病，可用波尔多液喷洒防治【1】。 1.3、贝母主要药用品种 贝母在我国有悠久的药用历史，其种类较多，中国植物志（1980）-记载贝母属植物有 20 种及 2 变种。中华人民共和国药典（2010）收载有川贝母、浙贝母、平贝母、土贝母等 6 种。目前主要的药用品种见下表： 表 1 贝母属主要的药用品种 1.4、川贝母基础物质研究现状及重要性： （1）近年来对贝母化学成分的

4、研究取得了一定进展，但川贝母的化学成分有许多尚待进一步研究：习惯上用贝母的总生物碱含量作为其品质评价标准，但结果与传统用药经验有不符之处，而药理试验亦多以总碱进行，对于其中某单一生物碱成分药理试验较少。因此，对川贝母的主要化学成分深人研究，阐明其有效成分及各生物碱的药理活性，制定规范化的质量标准，这对于川贝母的质量控制及合理利用和开发有重要意义。 （2）国内已有不少现代技术应用于贝母鉴别的报道，应考虑将这些方法应用于实践并与传统鉴别经验结合，以便准确进行川贝母的鉴定。 （3）川贝母野生资源远不能满足市场要求，而数种川贝母基源植物的引种栽培、组织培养已获初步成功，但目前存在的主要问题是：其外观形

5、态与野生川贝母差异甚大，有必要进行更深入的研究，以探讨栽培条件与内在质量及外观形态的关系。 （4）川贝母从古至今用药只取地下鳞茎，但川贝植株均含有与鳞茎一致的有效成分。应进一步研究探讨川贝母植株的综合利用。 第二章川贝母有效成分的研究 2.1、生物碱 到目前为止我国已从贝母属植物中先后分离出 97 种生物碱，弄清了 73种生物碱的化学结构，其中异甾体生物碱就有 55 种。如张建兴报导【3】，浙贝母中含有浙贝甲素、浙贝乙素、贝母辛、贝母芬，贝母定、贝母替定、原贝母碱、浙贝母贰，异浙贝甲素。川贝母中含有川贝碱、山民贝碱、松贝碱、青贝碱、西贝素、梭砂贝母（习称炉贝）中除川贝碱外还分离出炉贝碱【4】。

6、伊贝母经分析鉴定有西贝素、西贝素贰、贝母辛、西贝素氮氧化物、新疆贝母中还含有新贝甲素及几种结构未定的生物碱【5.6】。本贝母中除含西贝素外，还有西贝素贰、贝母辛、西贝素氮氧化物，平贝碱甲、平贝乙碱【7】。彭泽贝母含有浙贝乙素、贝母辛、浙贝甲素、湖贝甲素、-甾谷醇等【8】。贝母含有浙贝甲素、浙贝乙素、异浙贝甲素、浙贝双酮，-谷甾醇、胡罗卜甙【9】。优异贝母含有湖贝乙素，湖贝嚓，湖贝甲素，湖贝甲素甙【10】。湖北贝母含有湖北啶，C-去甲-D 高甾体，生物碱甾醇、对映-贝壳杉烷型二萜【11】。宁夏贝母含有宁贝素、川贝酮、西贝素、贝母宁、异贝母甲素。午阳贝母含有浙贝甲素、午贝甲素、浙贝乙素，5-甲基午

7、贝甲素、午贝乙素，午贝丙素【12】安徽贝母含有皖贝甲素，异浙贝甲素、浙贝乙素，贝母辛【13】。宁国贝母含有浙贝甲素、浙贝乙素、异浙贝甲素、贝母辛、宁贝辛【14】。 至今可用 4 种方法测定贝母总生物碱。1）酸碱滴定法【15】2）安培滴定法【16】3）两相滴定法【16】4）酸性染料比色法【17】。90 年代初建立的酸性染料比色法测定贝母总生物碱的含量，随着分光光度计的不断普及，近年来该法越来越多地被用来评价贝母的内在质量。 2.2、腺苷 腺苷（adenosine）作为一种天然成分，己知具有抗凝血、扩张冠状动脉、松弛支气管平滑肌、镇静中枢神经、抗心率不齐和消炎等作用，近年来倍受人们的关注。 最近有

8、人以血小板活化因子（PAF）为诱导剂，对平贝母进行抑制血小板聚集成分研究时，发现其活性成分为 2 个水溶性核苷类化合物即胸苷（thyrnidine）和腺苷【18】，并应用薄层分离和双波长紫外分光光度法相结合，对平贝母、浙贝母、伊贝母和梭砂贝母进行了含量测定。结果显示 4 种贝母中均含有这 2 种核苷，且比例明显不同，伊贝母和平贝母中的腺苷约占总量的 90%，梭砂贝母中的腺苷约占 60%，而浙贝母中的腺苷约占40%，故认为浙贝母在临床上与其它贝母用法不同，可能与其核苷成分的含量差异有关【19】。 多年来对贝母及其制剂的内在质量评价取得一定进展，评价内容主要是对贝母总生物碱的含量测定，测定方法以酸

9、性染料比色法最为常用。单体成分的测定以薄层扫描法测定最为常用，HPLC 法测定单体生物碱受检测器的局限，其方法学仍需要深入研究。柱前衍生 HPLC 法虽取得一定进展，但实际应用还有不便之处。GC 法用于贝母单体生物碱的测定未有人尝试。 贝母内在质量的评价多涉及贝母药材、栽培品种和组织培养物与野生品种的比较、不同贝母种间比较等领域，而贝母制剂的质量评价和贝母有效成分的积累动态研究仍少见报道。贝母中核苷类成分、脂肪酸类成分的评价亦值得深入研究。而生物样品中贝母有效成分的分析仍是空白，有待探讨。第三章 川贝母有效成分的提取及分离 3.1、总生物碱的提取 总生物碱的提取方法有：溶剂法、离子交换树脂法、

10、水蒸气蒸馏法及减压蒸馏法。挥发性生物碱可采用水蒸气蒸馏法或减压蒸馏法提取。一般生物碱多采用溶剂法和离子交换树脂法。 3.1.1、溶剂法 溶剂法是最常用的方法。弱碱性或中等碱性生物碱往往以游离状态存在，可用苯或氯仿等有机溶剂提取，较强碱盐部分则留在植物体内。提取前应允用水或稀有机酸（如酒石酸、柠檬酸等）充分湿润植物粉状材料，然后用有机溶剂提取。如喜树碱、吲哚碱、长春碱和长春新碱等的提取均可采用此种方法。 甲醇或乙醇提取物含不少非生物碱成分，需进一步除去。常用适量酸水液使生物碱成盐溶出，过滤.酸滤液再用上述方法碱化、有机溶剂萃取、浓缩得亲脂性总生物碱。 对苷类生物碱的提取，一般直接将植物样品用甲醇

11、或乙醇渗漉或浸泡，浓缩后进行柱层析，注意宜采用新鲜原材料或先进行灭酶处理，应避免酸或碱处理，否则，会被水解。含油脂多的植物材料，则应预先脱脂。 3.1.2、离子交换树脂法 将水或酸水提取液通过强酸性阳离子交换树脂进行交换，以便与非生物碱成分分离。交换后树脂，用 10%氨水碱化树脂，再用乙醚、氯仿、甲醇等洗脱，浓缩得总生物碱。树脂多用强酸性且是磺酸型的，交联度十分重要，以 3%8%为宜。操作上，若用乙醚洗脱，则碱化十分关键，以有润湿感为指标。此法有很重要的实用价值。许多药用生物碱如奎宁、东莨菪碱等都是应用此法生产的。有时个别的生物碱.离子交换后.因为强吸附作用而难被有机溶剂洗脱下来。 3.2、生

12、物碱分离纯化 首先利用生物碱在不同溶剂中的溶解度不同达到预分离目的。即先将总碱溶于少量乙醚、丙酮或甲醇中，静置。如果析出结晶，过滤，滤液浓缩至少量或加入另一种溶剂，往往又可得到其他生物碱结晶.这通常又称为试验法。假如再没有结晶析出，那么剩下的一般是结构与性质比较相似的生物碱。分离此类生物，碱.可利用碱性强弱不同，溶解性能差异或特殊功能基等，先初步分成几个部分，然后再系统分离单体生物碱。 系统分离通常采用总生物碱类别或部位单体生物碱的分离程序。类别是指按碱性强弱或酚性、非酚性组分的生物碱类别。部位指最初层析中洗脱的不同极性的生物碱。 多数情况下，要灵活地综合运用各种方法进行提取分离、方能达到分离

13、目的。 3.3、川贝母皂苷的提取分离 总皂苷的提取采用皂苷提取通法正丁醇法，得到的总皂苷再用硅胶色谱法反复层析并反复重结晶，才能得到纯品。 4.1、药理作用 4.1.1、抑菌作用 1984 年熊玮等曾报道川贝母醇提物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有明显抑制作用。肖灿鹏等对几种贝母单体生物碱：贝母碱、去氢贝母碱和鄂贝定碱的抑菌实验表明，贝母碱对卡他球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、克雷伯氏肺炎杆菌有抑制作用，去氢贝母碱和鄂贝定碱对卡他球菌、金黄色葡萄球菌有抗菌活性，且鄂贝定碱对这两种菌的抗菌活性高于贝母碱和去氢贝母碱。虽然贝母的抗菌活性较弱，但是对于治疗呼吸道感染是有帮助的。 4.1.2、镇咳作用 贝

14、母为常用的止咳化痰药。中医传统认为浙贝母清热化痰、散结消肿；川贝母润肺止咳。李萍等对常用贝母进行了镇咳药理作用筛选，发现贝母的总生物碱部分对小鼠氨水引咳均有显著的镇咳作用。除梭砂贝母和伊贝母外，其余贝母的乙醇提取物亦有显著的镇咳作用【22】。钱伯初等浙贝母碱和去氢浙贝母碱是浙贝母镇咳的有效成分。从鄂北贝母总碱中分离出鄂贝定碱，从蒲贝总碱中得到蒲贝酮碱和 9207N。经实验证实这些生物碱及单体成分均具有显著的镇咳作用，且有用量小、毒性低的优点，是很有开发前途的天然高效止咳药【23、24】。汪丽燕等对贝母的镇咳机制进行了初步探讨，发现皖贝对电刺激神经无影响，也不对抗尼可刹米的呼吸兴奋作用，因此认为

15、贝母抑制咳嗽中枢而不抑制呼吸中枢，这对治疗慢性支气管炎并发肺气肿咳嗽者更为有利【25】。Gilani 等【26】人从王贝母F.imperialis 中分离得到一种生物碱鄂贝乙素，它选择性地作用于 M2 受体，与 M2 受体的亲和力高于 M3，为 M2 受体拮抗剂，这可能与贝母的作用机制有关。 4.1.3、祛痰作用 粘稠的痰易造成呼吸道阻塞而继发感染，刺激呼吸道引起咳嗽，因此祛痰药的基本功用之一是使痰液变稀易于咳出。实验证明，紫花鄂北贝母、鄂北贝母可增加气管腺体组织分泌，使痰液粘度下降而达到祛痰作用，加之贝母对平滑肌的松弛作用也有利于痰液排出与减轻咳嗽【27】。李萍等发现市场上常用贝母的总皂苷部

16、分均能使小鼠呼吸道中酚红排泌量非常显著地增加，除浙贝母、紫花鄂北贝母、鄂北贝母以外的贝母醇提取物均有显著的祛痰作用，但醇提物和总生物碱部分的祛痰作用远不如皂苷部分，说明贝母总皂苷部分可能是祛痰的有效成分。汪丽燕等将大鼠迷走神经切断后采用毛细管排痰实验法，发现给药后排痰量显然增加，证实了贝母为非恶心性祛痰药。同时还发现皖贝可能使动物损伤的支气管粘膜上皮修复，粘膜内杯状细胞密度增加，降低炎症时气管粘膜血管的通透性，减少渗出，但不影响气管分泌物内酸性粘多糖纤维的数量和形态。 4.1.4、平喘作用 哮喘是由于过敏原或其他非过敏因素引起的气管和支气管对各种刺激的反应性增高而导致广泛、可逆的气道狭窄。早在

17、 1935 年张耀德就发现支气管平滑肌对浙贝母素很敏感，其收缩和舒张与药物的剂量有关。随着研究的深入，人们发现川贝、平贝湖北贝母、鄂北贝母【28】等都具有明显的平喘功效。贝母的平喘机制一般认为与其松弛支气管平滑肌，减轻气管、支气管痉挛，改善通气状况有关。此外，熊玮等发现贝母醇提物能明显提高小鼠常压耐缺氧能力，即能降低组织对氧的需要量，这对哮喘病人也是有利的。 4.1.5、镇静、镇痛作用 张昌绍指出贝母有中枢抑制作用。人们在研究中发现浙贝母碱和去氢浙贝母碱在 2mg/kg 的剂量下能够减少小鼠自发活动，并能对抗咖啡因所致的活动次数增加，与氯丙嗪对抗咖啡因的作用相协同。浙贝母碱和去氢浙贝母碱能够延

18、长小鼠戊巴比妥睡眠时间及提高睡眠率，对小鼠腹腔注射醋酸所致的扭体反应也有抑制作用。章鸣玉等也发现宁国贝母碱与镇静药和解热镇痛药具有协同作用。 4.1.6、心血管作用 贝母素丙 4.2mg/kg 的剂量可导致猫的血压缓慢降低，并最终维持在较低水平。湖北贝母总碱对猫血压也有短时中等程度的降压作用，与阿托品作用相似，但机制是否相同尚需进一步证实。 从浙贝母中得到的 13hydroxyl-9，1-octedecadienoicacid 及其盐能够抑制血管紧张素转化酶活性，从而降低血压，已作为抗高血压药应用于临床【29、30】。李萍等【31】研究了 4 种贝母生物碱（FH 1 FH4）对离体豚鼠及大鼠心

19、肌、兔胸主动脉条和蟾蜍坐骨神经干生理效应的影响，表明 FH1 与 FH4 具有正性肌力、负性频率和舒张血管作用，其作用机制与 受体激动剂和强心苷均不同。在离体血管上，FH1FH4 均可明显对抗甲氧胺引起的血管收缩作用，对神经动作电位无影响，其正性肌力作用机制可能与抑制磷酸二酯酶（PDE）有关。 4.1.7、抗溃疡作用 平贝总碱对大鼠结扎幽门性溃疡、消炎痛型溃疡及应激性溃疡都有一定的抑制作用。局部溃疡的形成是胃壁组织被胃酸和胃蛋白酶消化的结果，这种自我消化过程是溃疡形成的直接原因，因而平贝总碱抑制胃蛋白酶活性可能是其抗溃疡作用机制之一。 4.1.8、抗血小板聚集作用 陈泽乃等【30】根据 4 种

20、贝母抑制由血小板活化因子（PAF）诱导血小板聚集的有效部位筛选结果，从平贝母的水溶性活性部位中分得胸苷和腺苷等成分。实验表明腺苷为抑制血小板聚集的主要成分。由于 PAF 具有Ca2+载体作用，能刺激和引起 Ca2+流的产生，而腺苷却能兴奋腺苷环化酶，刺激 cAMP 形成，从而降低血小板内苷的含量，起到抑制聚集的作用。最近报道腺苷尚能活化白细胞上的 A2 受体，有效地阻止 PAF 诱导的白细胞内皮细胞粘附而参与抗炎过程，提示贝母可能有抗炎作用。 4.1.9、抗肿瘤作用 土贝母系葫芦科植物，有清热解毒、消肿散结、祛痰之功效，可用于治疗乳腺癌，对于实验性小鼠宫颈癌也有较为满意的疗效。李萍等从蒲圻贝母

21、中提取的蒲贝酮碱显示了强的抗小鼠艾氏腹水癌（EAS，实体型）、宫颈癌（U14 实体型）及肝癌（HePA，实体型）的活性。鄂北贝母的抗肿瘤实验结果表明，其总生物碱对小鼠移植肝实体瘤具有明显的抑制作用，口服1Omg/kg 共 8d，肿瘤抑制率与相同剂量的 5-FU 相当。进一步研究表明，其抗肿瘤成分为鄂贝定碱、浙贝甲素和浙贝乙素。 4.1.10、其它作用 熊玮等发现贝母醇提取物在 410-3gl/mL 剂量下对乙酰胆碱所致的肠肌收缩有明显的松弛作用。贝母总碱对兔瞳孔有明显扩张作用，其作用强度与阿托品间无显著性差异（P0.05）。贝母还有升高血糖及增加肺脏cAMP 水平的作用。 4.2、毒性作用 贝

22、母的急、慢性毒性实验表明，除使动物气管及支气管有杯状细胞增生、增多外未见其它异常。 咳、痰、喘是呼吸系统疾病的常见症状，贝母确有镇咳、祛痰、平喘之功效，其镇静、耐缺氧作用对于哮喘病人非常有利，其消炎抗菌作用能协同治疗呼吸道感染。近来由贝母提取出的总生物碱、总皂苷和单体生物碱作用更为确切，因此是很有开发前途的纯天然高效药物。 贝母的药理研究虽然取得了一定进展，但与大量的化学工作相比，药理研究工作显得不够深入。今后对贝母的药理学研究工作除了进一步对贝母属植物进行活性筛选外，还应对分离得到的被证明有显著活性的单体成分进行动物体内的代谢研究，探讨其药动学与药效学的关系，这是阐明贝母的作用机制所必需的，

23、也是开发贝母新制剂、实现贝母现代化研究所必需的。 第五章 川贝母物质基础研究思路 本文主要针对川贝母基础物质研究项目进行论证，首先分别对川贝母常规化学成分进行研究和其他活性成分及微量元素进行研究，再对这些成分进行药效研究。通过对川贝母的化学组分、有效成分、药效机理的几个方面的研究，全面阐述川贝母的物质基础研究，为川贝母的品种保护和资源开发起到了积极的推进作用。 参考文献 李强，组培川贝母（Fritillaria Cirrhosa D.Don）鳞茎形成和发过程中的生理生化研究 高锦明，植物化学.2003 张建兴，浙贝母新鲜鳞茎化学成分的研究中国中药杂志 1993；18 （6）：354 马鸿年，川贝母商品松贝和青贝的生物碱含量，中国中药杂志1995；20（3）：172 刘庆华，新疆贝母化学成分研究药学学报 1984；19（12）：894 徐东铭伊贝母生物碱的研究，植物学报 1990；32 王淑琴，平贝母生物茎叶的生物碱成分，中国中药杂志 1991；16（9）：554 （下接第 51 页）