大鼠磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶AMPKELISA试剂盒.DOC

1、大鼠磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶 (AMPK)ELISA试剂 盒 本试剂盒仅供研究使用。 检测范围： 96T 0pg/ml-160pg/ml 使用目的： 本试剂盒用于测定 大鼠 血清、血浆及相关液体样本中 磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)含量 。 实验原理 本试剂盒应用双抗体夹心法测定 标本 中 大鼠磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶 (AMPK)水平。用纯化的 大鼠磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶 (AMPK)抗体包被微孔板，制成 固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入 磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶 (AMPK)， 再与 HRP 标记的 磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶 (AMPK)抗体结合，形成抗体 -抗原 -酶标抗体复

2、合物 ，经过彻底洗涤后 加 底物TMB 显色。 TMB 在 HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的 磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶 (AMPK)呈正相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度（ OD 值）， 通过标准曲线 计算样品 中 大鼠磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶 (AMPK)浓度。 试剂盒组成 1 30 倍浓缩洗涤液 20ml 1 瓶 7 终 止液 6ml 1 瓶 2 酶标试剂 6ml 1 瓶 8 标准 品（ 160pg/ml） 0.5ml 1 瓶 3 酶 标包被 板 12 孔 8 条 9 标准品 稀释液 1.5ml 1 瓶 4 样品 稀释液 6ml

3、 1 瓶 10 说明书 1 份 5 显色剂 A 液 6ml 1 瓶 11 封板膜 2 张 6 显色剂 B 液 6ml 1/瓶 12 密封袋 1 个 标本要求 1标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可 将标本放于 -20保存，但 应 避免反复冻融 2不能检测含 NaN3 的样品 ，因 NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（ HRP）活性。 3. 血清： 室温血液自然凝固 10-20 分钟后，离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 /分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。 4. 血浆： 应根据标本的要求选择 EDTA、柠檬酸钠或

4、肝素作为抗凝剂，混合 10-20 分钟后，离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 /分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。 5. 尿液： 用无菌管收集。离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 /分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、 脑脊液参照此实行。 6. 细胞培养上清： 检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 /分）。仔细收集上清。 7. 培养细胞 检测细胞内的成份时，用 PBS（ PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到 100 万 /ml左右。通过反复冻融或加入组织蛋白萃取试剂，

5、以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 /分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。 8. 组织标本 切割标本后，称取重量。加入一定量的 PBS， PH7.4。用液氮迅速冷冻保存 备用。标本融化后仍然保持 2-8的温度。加入一定量的 PBS（ PH7.4），或组织蛋白萃取试剂 , 用手工或匀浆器将标本匀浆化。离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 /分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。 自备材料 1 蒸馏水。 2 加样器： 5ul、 10ul、 50ul、 100ul、 200、 500ul、 1000ul。 3 振荡

6、器及磁力搅拌器等 操作步骤 1. 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。 2. 80pg/ml 5 号标准品 150l 的原倍标准 品加入 150l 标准品稀释液 4opg/ml 4 号标准品 150l 的 5 号标准品加入 150l 标准品稀释液 20pg/ml 3 号标准品 150l 的 4 号标准品加入 150l 标准品稀释液 10pg/ml 2 号标准品 150l 的 3 号标准品加入 150l 标准品稀释液 5pg/ml 1 号标准品 150l 的 2 号标准品加入 150l 标准品稀释液 3. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试

7、剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔 。在酶标包被板上标准品准确加样 50l， 待测样品孔中先加样品稀释液 40l，然后再加待测样品 10l（样品最终稀释度为 5 倍）。 加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁， 轻轻 晃动 混匀 。 4. 温育：用封板膜封板后置 37温育 30 分钟 。 5. 配液：将 30 倍浓缩洗涤液用蒸馏水 30 倍稀释后备用 6. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体， 甩干 ，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此重复 5 次，拍干。 7. 加酶：每孔加入酶标试剂 50l，空白孔除外 。 8. 温育：操作同 3。 9. 洗涤：操作同 5。 10. 显色：每

8、孔先加入显色剂 A50l，再加入显色剂 B50l，轻轻震荡混匀， 37避光显色15 分钟 . 11. 终止：每孔加终止 液 50l，终止反应 （此时蓝色立转黄色） 。 12. 测定：以空白空调零， 450nm 波长依序测量各孔的 吸光 度（ OD 值） 。 测定应在加终止液后 15 分钟以内进行。 操作程序总结： 计算 以标准物的浓度为横坐标， OD 值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以 稀释倍数 ；或用标准物的浓度与 OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的 OD 值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以 稀释倍数 ，即为样品的实际浓度。

9、 注意事项 1试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡 15-30 分钟后方可使用， 酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。 2 浓洗涤液 可能 会有 结晶 析出，稀释时可在水浴中加温助溶 ，洗涤时不影响结果。 3各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在 5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。 4 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本 OD 值大于标准品孔第一孔的 OD 值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（ n 倍）后再测定，计算时请最后 乘以 总稀释倍数（ n 5）。 5 封板膜只限一次性使用，以避免交叉

10、污染。 6底物请避光保存。 7严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准 . 8所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。 9本试剂不同批号组分不得混用。 10. 如与英文说明书有异，以英文说明书为准。 性能 1. 灵敏度：最小的检测浓度小于 1 号标准品。稀释度的线性。样品线性回归与预期浓度相关系数 R 值为 0.990。 2. 特异性：不与 大鼠 其它细胞因子反应。 3. 重复性：板内、板间变异系数均小于 10%。 4. 局限性： 6 号标准品以上的结果为非线性的，根据此标准曲线无法得到精确的结果。 保存条件及有效期 1 试剂盒保存： ； 2-8 。 2有效期： 6 个月