凹凸棒土对黄曲霉毒素B1吸附率测定方法的研究（超高效液相色谱法）.doc

1、凹凸棒土对黄曲霉毒素 B1 吸附率测定方法的研究（超高效液相色谱法）摘要：凹凸棒土具有较大的比表面积，且储量丰富，价格便宜，可作为黄曲霉毒素 B1（AFB1）的吸附剂。根据毒素吸附剂在水溶液中与毒素充分混合能够吸附毒素的原理，本研究利用凹凸棒土与黄曲霉毒素 B1的水溶液在 37充分混合，然后离心检测上清液中的黄曲霉毒素 B1 毒素残留量，通过与空白对照进行比较，计算吸附剂对毒素的吸附率。 关键词：凹凸棒土 黄曲霉毒素 B1 吸附率 超高效液相色谱 凹凸棒土呈纤维网状结构，比表面积大，含有多种动物所需的矿物元素。凹凸棒土粉作为混合饲料的添加剂，以其特有的物理性能，能促进动物机体的新陈代谢，提高饲

2、料转化率，使动物食欲旺盛，皮毛丰润，增重快，出栏早，降低饲养成本。同时还具有优良的吸附性，能有效地吸除动物的大肠肝菌、生物毒素等，起到防疫治病、除虫杀菌的作用，并提供牲畜生长必要的微量元素。我市盱眙地区的凹凸棒土品位高、储量大，优质凹凸棒石粘土已探明储量在 6700 万吨以上，有用粘土总量达9 亿吨。本文主要研究的是利用液相色谱法测定凹凸棒土对黄曲霉毒素B1 的吸附率。本文参考国家标准 GB/T 5009.23-20061 食品中黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2 的测定样品处理方法对黄曲霉毒素进行衍生化后利用液相色谱荧光检测器测定。 1 材料和方法 1.1 材料与试剂 凹凸棒土（江苏盱眙）

3、，黄曲霉毒素 B1 标准品（SIGMA） ；正己烷、三氟乙酸、乙睛（色谱级） ；Milli-Q 超纯水（美国 Millipore） 1.2 仪器与设备 恒温摇床；高速离心机；分析天平；水浴锅；氮吹仪；涡旋混合仪；高效液相色谱仪：Waters ACQUITY 超高效液相系统：四元低压梯度泵，自动进样器，荧光检测器； 1.3 实验步骤 1.3.1 标准溶液配制 黄曲霉毒素 B1 标准储备液（100 ug/ml）：准确称取黄曲霉毒素 B1 0.0100g，用 30%乙腈水溶液定容至 100ml，振荡均匀后即得 100 ug/ml的黄曲霉毒素 B1 标液； 黄曲霉毒素 B1 标标准使用液（1 ug/m

4、L）：取 100ug/mL 黄曲霉毒素B1 1.00 mL，用 30%乙腈水溶液定容至 100 mL，振荡均匀后即得 1 ug/ml的黄曲霉毒素 B1 标液； 将配置的 1 g/mL 的标准溶液稀释成浓度为 100g/L 的标准使用液，然后取 8、40、80、160、400 L，按样品处理方法处理后，用流动相定容到 1.00 mL。浓度分别为 0.8、4.0、8.0、16.0、40.0 g/L。过0.45m 滤膜，待用。 1.3.2 色谱条件 色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18 （1.7m ，2.150mm） 流动相：乙睛：水=20：80（v/v）流速：300L/min； 柱温：

5、35； 进样体积：5L； 检测波长 Ex：365nm，Em：440nm； 1.3.3 样品处理 精确称取 10-20 mg（称准至 0.0002 g）凹凸棒土样品放入一个的耐热玻璃制的带螺帽的样品瓶振荡中，加入 1.0 mL 黄曲霉毒素 B1 标液（1 g/mL） ，然后定量加入 9.0 mL 纯水。小心的将小瓶盖紧后将小瓶放入37 恒温摇床中以 150 rpm 摇动处理 90min。完成后将溶液在 5000 rpm离心 3 min，然后取上清液备用。同时按上述方法制备一个不添加凹凸棒土样品的空白对照。 根据上述离心上清液中黄曲霉毒素 B1 的实际含量取一定体积（200400 L）的样品溶液，

6、在 60 下，用氮吹仪吹干。加入 200 uL 正己烷和 100 uL 三氟乙酸，在涡旋混合仪上混合均匀，然后在 40水浴中衍生反应 10 min。取出衍生后的样品溶液，在 60 下用氮气吹干，使用过滤后的流动相定容到 1.00 ml，待测。 1.3.4 计算 100 % 其中：R凹凸棒土对黄曲霉毒素 B1 的吸附率，%； A样品溶液中黄曲霉毒素 B1 的色谱峰面积； A0不加凹凸棒土空白对照溶液中黄曲霉毒素 B1 的色谱峰面积。 2 实验结果 2.1 标准曲线与线性范围 取不同水平的黄曲霉毒素 B1 标准溶液，按 1.3.2 节建立的仪器条件进行 UPLC 测定。计算不同标准水平下的峰面积，

7、以黄曲霉毒素标准品水平/（g/kg）为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线。直线几乎通过原点，故通过原点进行线性回归。标准曲线在 040.0 g/L 的进样水平范围内线性良好。线性方程及相关系数见表 1。 表 1 黄曲霉毒素 B1 的线性方程和相关系数 毒素 回归方程 相关系数 r 黄曲霉毒素 B1 Y=1.46e+005X-1.14e+005 r=0.9989 2.2 样品精密度测试： 通过对 4 组不同规格的凹凸棒土样品进行测定，测试结果见表 2。结果表明，不同规格的凹凸棒土对黄曲霉毒素 B1 吸附率不同，同种规格的凹凸棒土对黄曲霉毒素 B1 的吸附率结果稳定。 图 1 黄曲霉毒素 B1 标

8、准溶液的超高效液相色谱图 表 2 四种规格凹凸棒土对黄曲霉毒素 B1 吸附率（n=5） 1 2 3 4 5 凹凸棒土 1# 84.8% 85.3% 84.6% 85.5% 86.3% 凹凸棒土 2# 88.2% 88.9% 89.0% 88.5% 89.5% 凹凸棒土 3# 90.4% 89.6% 90.5% 89.3% 88.9% 凹凸棒土 4# 61.2% 62.4% 61.4% 61.8% 62.3% 3 讨论 淮安盱眙地区自然资源丰富，地下蕴藏有丰富的凹凸棒石粘土。通过对各矿区勘查出的粘土矿储量统计以及资源潜力远超预测，盱眙凹凸棒石粘土矿资源总储量 9 亿多吨，占全国储量的 74%以上

9、，世界储量的50%，是国内最具有开采价值的蕴藏地。开发和利用好凹凸棒土资源，应进一步研究和解决对凹凸棒土资源的统筹开发利用。凹凸棒土对 AFB1 的吸附受凹凸棒土的加入量与 AFB1 的浓度共同影响。凹凸棒土对 AFB1 的吸附作用与凹凸棒土的类型有关，其吸附由凹凸棒土的表面活性部位离子种类及疏水性等共同决定，即凹凸棒土对 AFB1 的吸附是由几种吸附机制共同决定的2。本文研究的液相色谱法测定凹凸棒土对黄曲霉毒素 B1的吸附率，快速、高效、测定结果稳定，将为我市利用凹凸棒土生产黄曲霉毒素吸附剂的生产企业的提供很好的理论支持。 参考文献： 1GB/T 5009.23-2006食品中黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2 的测定S.北京：中国标准出版社，2006. 2 肖雷，马惠荣，姚菁华，戴祖明.凹凸棒土对黄曲霉毒素 B1 的吸附特性J.江苏农业科学，2012，40（8）：285-286.