生殖器疱疹和尖锐湿疣的检测技术.pptx

1、一、生殖器疱疹,朱参胜 主任技师陕西省皮肤性病防治所陕西省性病中心实验室,2018/7/10,单纯疱疹病毒（HSV）引起单纯疱疹病毒（HSV)，大小：150-200nm；DNA病毒；20面核衣壳；胞膜；衣壳蛋白感染生殖器、肛门复发，无彻底治愈的方法具有嗜感觉神经节，形成潜伏感染状态检测方法：细胞培养、核酸检测、直接免疫荧光、型特异性血清型抗体检测法,2018/7/10,2018/7/10,胞膜糖蛋白：,HSV有10-11种特异性糖蛋白抗原是细胞和体液免疫的主要靶标也是预防和治疗HSV感染的亚单位疫苗或DNA疫苗的候选基因gB,gC,gD,gE,gF,gG,gH,gI,gJ,gL,gM其中gG是

2、型特异性糖蛋白，具有型特异性抗原决定簇，诱导产生特异性抗体HSV抗原型：HSV1和HSV2,2018/7/10,2018/7/10,2018/7/10,HSV-2引起的生殖器和口腔疱疹,2013.8,陕西省皮肤性病防治所 朱参胜,2018/7/10,2018/7/10,HSV-1和HSV-2同源性高达50感染方式与临床表现不同 HSV-1：主要上半身皮肤和粘膜（口唇、咽、眼等）疱疹，严重者疱疹性脑炎 ，STI达10-40%； HSV-2：主要生殖器感染（80），偶可发生口腔及其周围感染。 HSV-1复发少，HSV-2复发高,HSV感染的临床表现一、疱疹：10-20% 1. 初发疱疹： 原发 ：

3、无病史且HSV1/2抗体阴性 非原发 ：一种抗体阳性，而引起疱疹病毒型抗体阴性。 原发与非原发临床不能区别，必须实验室鉴别。 第一次症状（复发）：血清学阳性但以前未出现疱疹 2. 复发疱疹：有典型病史，HSV2较1复发率高，男比女高二、潜伏感染：80-90HSV感染,2013.8,HSV传播途经,来自无症状的排毒者（最常见）70HSV2感染来自性伴无症状排毒期。通常有症状期性活动较少。多数病例否认与感染者接触的病史。与传染性溃疡接触（ 排毒达高峰，传染性最强）母婴传播：分3个阶段子宫内：经胎盘或宫颈上行感染，导致胎儿早产、流产、畸形、死亡。围产期：占85，经产道40-60机会被感染出生后：接触

4、外部HSV传染源，如母亲口腔感染等。,2013.8,HSV感染后,潜伏活动导致长期持续感染新生儿疱疹发病率和死亡率严重HIV感染协同因素80-90HSV感染为潜伏感染,2013.8,基本原理：HSV在细胞内寄生体外细胞培养特征细胞改变观察。标本采集：疱液：抽取或棉签吸取后洗脱。溃疡组织液：干拭子去除污物，棉签吸取后洗脱。子宫颈分泌物：拭去黏液后，用另一棉拭子插入子宫颈，捻转取样。仪器设备：CO2培养箱，细胞（Hela细胞），RPMI1640，小牛血清等。,（一）细胞培养法,2013.8,陕西省皮肤性病防治所 朱参胜,操作步骤：单层细胞制备：24孔板培养，长成单层细胞备用（常用细胞株为Vero,

5、 Hela, BHK)标本接种：接种0.2ml，培养37日CPE (cytopathic effect)观察：接种后，每日观察病毒传代：至少50%以上细胞出现CPE后，收集培养物，再次接种至新鲜细胞中。鉴定和分型：50%以上细胞出现CPE后，收集感染细胞和培养物，离心后，沉淀用免疫荧光或酶免试验鉴定。,2013.8,陕西省皮肤性病防治所 朱参胜,结果判读：观察CPE:连续7日观察，细胞一般在24日出现病变，变圆，肿胀和气球样变，可见融合细胞和多核巨细胞，初步判定HSV阳性。用免疫荧光法对HSV进一步鉴定和分型。结果报告：出现CPE: “单纯疱疹病毒分离可疑”鉴定后：“单纯疱疹病毒I型（II型）

6、生长”临床意义：细胞培养法是“金标准”用免疫荧光法对HSV进一步鉴定和分型,2013.8,陕西省皮肤性病防治所 朱参胜,注意事项:选择敏感细胞系，且细胞应为活力强的幼龄细胞取材时不用消毒剂和润滑剂尽量取水泡液或脓疱液进行接种培养取材后尽快接种，24h不能接种，存放于-70其他疱疹病毒如水痘，带状疱疹病毒感染也可以引起类似的CPE，因此需要进一步鉴定,2013.8,陕西省皮肤性病防治所 朱参胜,HeLa细胞株是由正常子宫颈细胞被一种人类乳突状瘤病毒（Human Papillomavirus 18 或HPV18）转型成癌细胞的，而且和正常子宫颈细胞有许多不同。,2013.8,陕西省皮肤性病防治所

7、朱参胜,Hela 细胞感染HSV-2:A 正常细胞；B:HSV-2感染细胞。,2013.8,陕西省皮肤性病防治所 朱参胜,（二）直接免疫荧光抗原检测,基本原理：HSV抗体(标记FITC)标本HSV荧光显微镜观察标本采集：细胞培养标本：收集细胞培养阳性标本，可作细胞爬片。病损标本：收集病损部位基底部细胞仪器设备：荧光显微镜；HSV(I/II)mAb; PBS溶液操作步骤：固定：冷丙酮（-20）或甲醇固定标本10min洗涤：PBS洗3次，或自然干燥染色：双份标本中滴加HSV-1和HSV-2荧光抗体工作液，37湿盒30min洗涤：PBS,双蒸水封片镜检：90%甘油+10%PBS,2013.8,陕西省

8、皮肤性病防治所 朱参胜,结果判读：阳性、阴性对照结果正常阳性标本为亮绿色荧光结果报告：阳性：见到上述荧光阴性：未见到上述荧光临床意义：一般用于HSV分离培养阳性标本的鉴定和分型注意事项:每批试验均设置对照高质量荧光显微镜和技术熟练操作人员取材是应避免出血，以免影响结果判断直接皮损标本：容易脱片,2013.8,陕西省皮肤性病防治所 朱参胜,2013.8,陕西省皮肤性病防治所 朱参胜,（三）抗原ELISA法,基本原理：抗HSV单克隆抗体包被标本HSV抗原酶标记抗体，底物显色。标本采集：同细胞培养法操作步骤：加样：对照和样品，孵育加酶结合物：洗板后，加入酶结合物，孵育显色：终止：,2013.8,陕西

9、省皮肤性病防治所 朱参胜,结果判读：阳性、阴性对照在规定范围根据要求计算设定阈值结果报告：阳性阴性临床意义：临床上常用的检测抗原的方法注意事项:采用部位正确，尽可能多采样不同批号试剂禁止混用,2013.8,陕西省皮肤性病防治所 朱参胜,（四）抗体检测,ELISA:检测原理：将型特异性HSV抗原gG包被在酶标板微孔中俘获血清中的HSV抗体，形成抗原抗体复合物再与辣根过氧化物酶标记的抗人抗体结合，加入酶底物显色酶标仪比色定量血清中HSV抗体含量。器材：酶标仪，洗板机、恒温水浴箱、型特异HSV-ELISA试剂盒。检测流程：试剂准备（平衡，混匀，稀释，阴性，阳性对照设置；加入标本；温育；洗版；加酶标记

10、物；洗板；显色；终止；读板。结果判读及报告：阳性、阴性对照应在要求范围；临界值确定。阳性、阴性判定。CIA:(省略）,2018/7/10,HSV型特异性抗体检测的临床意义,HSV感染诊断：首次感染93IgM阳性，复发感染13以下，IgGHSV分型诊断：HSV1和HSV2感染的严重程度和预后存在差异，为预后提供参考依据。原发与复发疱疹类型的鉴别检出隐性感染：80-90%无症状感染，减少性与母婴传播,2018/7/10,感染者性伴的HSV感染状况的判断：80%以上的患者渴望了解自身和伴侣的HSV感染的血清型，并且获知结果后对治疗方案的依从性增加79%。HSV感染的血清流行病学调查：为卫生监管部门提

11、供更加有效、可靠的HSV的流行病学数据。用于性病门诊（诊断与高危人群筛查）生殖医学门诊 (提高IVF的成功率)妇产科门诊(孕前和产前筛查，减少新生儿疱疹感染)器官移植科（检测HSV感染）,2018/7/10,（五）核酸检测,目的基因：目前均选择高保守序列区，主要集中在DNA聚合酶基因区、胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因区、糖蛋白基因区。原理：一对单纯疱疹病毒型特异性引物一条单纯疱疹病毒型特异性荧光探针，配以PCR反应液、Taq酶、dNTPs,用PCR体外扩增法检测单纯疱疹病毒DNA临床意义：鉴别诊断溃疡或生殖器疱疹的患者，区分I和II型HSV病毒；对脑组织、脑脊液测定有优势。,2018/7/10,

12、（六）检测方法评价,急性期感染确诊：培养法：金标准，试验条件，人员素质要求高。免疫学方法：区分型别。核酸检测：敏感性最高，SFDA认可的试剂；HSV感染筛查，无症状感染者检查：血清抗体检测（ELISA/CIA)：妇产科、性病门诊广泛使用，说明以前感染过HSV，IgM近期感染。,2018/7/10,二、尖锐湿疣,尖锐湿疣：(Condyloma Acuminatum ,CA)，又称生殖器疣，是由人乳头瘤病毒(Human papilloma virus,HPV)引起，主要通过性传播、在肛门及外生殖器所致的表皮瘤样增生的一种STD。HPV：人类乳突病毒（Human Papillomavirus，）是一

13、种分子较小（直径55nm）的DNA病毒。已知的人类乳突病毒有一百多种基因型，其中有三十余种会感染人类生殖器官的皮肤及黏膜，造成各种疾病。主要类型为HPV1、2、6、11、16、18、31、33及35型等，其中HPV16和18型长期感染可能与女性宫颈癌的发生有关。,2018/7/10,病毒DNA：8000个碱基对非编码上游调节（ LCR ）,早期 ORF(E1- - E7) ；晚期 ORF(L1 和 L2)分型：按E6,E7,L1的ORF，DNA序列同源性小于90%HPV的致病性:引起细胞良性增生：扁平疣、寻常疣、尖锐湿疣诱导细胞永生化和转化:宫颈癌、 肛门癌检测方法：HPV核酸检测和组织病理检

14、测。,2018/7/10,根据HPV引起细胞病理变化的不同，分为高危型和低危型 高危型 ：16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68 低危型：6、11、42、43、44,2018/7/10,HPV传播途径, 性接触传播：HPV的主要感染方式，相同的HPV亚型可以在性伴侣中检出。 直接接触：皮肤直接接触也是传播方式 母婴传播：母亲生殖道HPV感染也可以传给婴儿,2018/7/10,症状和体征,HPV感染后，潜伏期3周8个月，平均3个月。男性：多见于冠状沟、包皮、系带、龟头和肛周，其次是尿道口、阴茎体和阴囊；女性：多见于大小阴唇、后联合、阴蒂、宫颈、阴道壁和肛周。

15、其它：腋下、腹股沟、乳房下和口腔内,2018/7/10,特征,初发为淡红、褐色细小丘疹，针头至绿豆大小。以后突起，逐渐增大增多并扩散蔓延，表面粗糙。疣体：丘疹型、乳头型、菜花型、鸡冠型和巨大型CA。一般无感觉，部分有异物、痒或压迫感，或因磨擦而破溃、糜烂，性交易出血。女性患者常伴阴道炎。鉴别诊断：假性湿疣 （阴茎珍珠状丘疹，绒毛状小阴唇），扁平湿疣、鲍温样丘疹病和鳞状细胞癌。,2018/7/10,2018/7/10,部位：外生殖器或肛门皮损特点：疣状、菜花状赘生物,2018/7/10,2018/7/10,醋酸白试验：用5%醋酸溶液涂抹皮损处，35 min后皮损表面变白，辅助性诊断。,实时荧光P

16、CR技术,基本原理：两类引物：通用引物针对L1的保守区，可以扩增所有性病相关HPV-DNA；另一类特异的引物和探针。探针：标记不同荧光的型特异性探针；5端R基团和3端Q基团；反应前探针完整，无荧光；反应后，R基团和Q基团分离，产生荧光；每完成一次扩增，就形成一个荧光分子自动荧光检测仪测定仪器设备：荧光PCR仪；恒温水浴；高速离心机；试剂盒；标本采集：宫颈分泌物阴道分泌物男性尿道分泌物组织表面标本,2018/7/10,标本的采集, 标本取材部位：宫颈，外阴，包皮龟头等 标本类型：赘生物、丘疹、无症状等 采集方法： 赘生物用钝刀或拭子刮取组织细胞 宫颈拭子 直肠拭子的取材,2018/7/10,操作

17、步骤：分泌物和刮取物标本的处理：充分振荡，洗脱至1ml生理盐水中，12 000rpm离心5分钟，弃上清；新鲜组织需匀浆；石蜡包埋组织：切片，脱蜡、乙醇洗涤干燥，提取。DNA提取：加入DNA提取液，煮沸10min，离心上清液为模版；加样：PCR反应管加入阳性、阴性对照，样品PCR扩增：将反应管放入PCR仪，设置名称，反应条件，荧光种类，并开始运行仪器。,2018/7/10,结果判读及报告：实验有效性判断，阴性不是S型曲线，阳性为S型曲线，CT=给定值或参考范围。根据CT值，确定阴性，阳性，可疑。临床意义：很高的敏感性和特异性，HPV检测较为可靠的方法大量人群感染HPV不发病，用于尖锐湿疣时，结合

18、临床症状和流行病学史综合分析不典型症状确诊尖锐湿疣疗效判定注意事项：分区进行检测-球蛋白基因评价标本是否合格阴性不排除其他型别HPV感染（100种）,2018/7/10,核酸杂交技术,HPV基因直接杂交：原位杂交、斑点杂交、southern转移杂交；扩增后杂交：反向膜杂交、杂交捕获法原位杂交：细胞内HPV病毒的检测和定位。southern转移杂交：电泳分离后杂交。杂交捕获法：唯一通过FDA批准，RNA探针，杂交，化学发光放大信号，检测低危和高危HPV，不能分型。反向斑点杂交：国内SFDA注册批准，生物素/地高辛标记的通用引物扩增目的基因，双链DNA扩增产物经变形后与固定于硝酸纤维素上特异性探针

19、进行杂交，加入酶标地高辛抗体，加入底物，显色反应，形成斑点，区分HPV型别。,2018/7/10,病理学检查法,基本原理：HPV感染疣状皮损细胞结构和排列发生改变：乳头瘤样增生、表皮角化不全、棘层肥厚、真皮浅层炎性细胞浸润、表皮内空泡化细胞等。标本采集:手术或剪除法切去病变组织，立即放入盛有10%中性福尔马林小瓶中固定。,2018/7/10,操作步骤：脱水： 将固定的组织块置入70%、80%、95%和无水乙醇中透明：置入二甲苯中浸蜡：热石蜡注入蜡模中，稍凝固后，放入组织块切片裱片：将切片贴在洁净载玻片上烤片：切片置入72烤箱中12h脱蜡：置入二甲苯中脱蜡1015min脱水： 100%、95%、

20、80%脱水12min染色：苏木素染色洗片：自来水冲洗15min分化：置入盐酸中分化1-2min染胞质：伊红染色脱水： 95%和无水乙醇中，各35min透明：二甲苯中二次封片：中性树胶,2018/7/10,结果判读细胞核深蓝色，胞质红色，可见乳头瘤增生，角化不全、角化过度、表皮荆棘层肥厚、基底细胞增生、真皮浅层血管扩张，并有淋巴细胞浸润。表皮浅层可见呈灶状、片状及散在分布空泡化细胞：该细胞体积大，核深染，核周围可见不同程度的空泡化改变，轻者核周围仅有空泡化的晕环，重者整个胞质均发生空泡化改变，胞质内可有丝网状或絮状改变结果报告：根据以上病理组织像进行报告,2018/7/10,临床意义：特征性病理

21、组织像可作为明确诊断尖锐湿疣的重要依据如在病理组织切片中未见空泡化细胞，仅见片状角化不全或表皮乳头瘤样增生时，并不能排除尖锐湿疣注意事项：必要时，应多取材和连续切片，直到查见特征性病理改变，结合临床进一步诊断典型病理改变高度提示HPV感染,2018/7/10,2018/7/10,检测方法评价,HPV实时定量PCR:无需扩增后续处理，但不能确定HPV的具体型别或确定的型别较少（6，11，16，18）；用于无症状筛查，有症状病原学诊断。HC-II法：诊断出高危和低危感染，不能确定具体型别；用于风险评估。PCR反向杂交技术：敏感，检测各种型别；用于风险评估。组织病理学：损伤大，诊断尖锐湿疣特异性高。

22、,2018/7/10,小结,CA由HPV感染引起，但HPV感染不仅仅引起CACA的诊断主要依赖与临床，实验室为辅助性HPV检测与分型：CA诊断、高危鉴定、复发判断。,2018/7/10,性病规范实验室验收（讨论）,发文（条件要求）申报条件：梅毒（ELISA/CIA（可选）、TPPA、RPR/TRUST，PCR（可选)淋病（培养法、PCR可选）CT（PCR法）HSV-1，2：ELISA/CIA，PCR尖锐湿疣：HPV-6，11/通用/分型验收,2018/7/10,陕西省淋球菌耐药监测点,发文（条件）市CDC落实每个市2个医院条件：开展淋球菌培养管理及人员培训：淋球菌培养、鉴定、标本的收集、保存验收,2018/7/10,2018/7/10,