高效液相常见问题及解决.doc

1、 高效液相色谱仪使用中常见问题及解决方法 高效液相色谱仪系统液相色谱仪主要由贮液瓶、泵、进样器、柱子、柱温箱、检测器、数据处理系统组成。对于整个系统而言，柱子、泵和检测器是核心部件同时也是易出问题的主要部位。 常见问题及解决方法高效液相作为一种高精密仪器，如果在使用过程中不按照正确操作的话，就容易导致一些问题。其中最常见的就是柱压问题、漂移问题、峰型异常问题。1 柱压问题 柱压问题是使用高效液相色谱过程中需要密切注意的地方，柱压的稳定与色谱图峰形的好坏、柱效、分离效果及保留时间等密切相关。所谓柱压稳定并不是指压力值稳定于一个恒定值而是指压力波动范围在 345kPa 以内或在 50PSI（针对

2、Waters 高效液相色谱仪）之间（在使用梯度洗脱时，柱压平稳缓慢的变化是允许的） 。压力过高、过低都属于柱压问题。1.1 压力过高 这是高效液相在使用中最常见的问题，指的是压力突然升高，1、一般都是由于流路中有堵塞的原因。此时，我们应该分段进行检查。(1).首先断开真空泵的入口处，此时 PEEK 管里充满液体，使 PEEK 管低于溶剂瓶，看液体是否自由滴下，如果液体不滴或缓慢滴下，则是溶剂过滤头堵塞。处理方法：用 30%的硝酸浸泡半个小时，在用超纯水冲洗干净。如果液体自由滴下，溶剂过滤头正常，在检查；(2).打开 Purge 阀，使流动相不经过柱子，如果压力没有明显下降，则是过滤白头堵塞。处

3、理方法：将过滤白头取出，用 10%的异丙醇超声半个小时。如果压力降至 100PSI 以下，过滤白头正常，在检查；(3).把色谱柱出口端取下，如果压力不下降，则是柱子堵塞。处理方法：如果是缓冲盐堵塞，则用95%的水冲至压力正常。如果是一些强保留的物质导致堵塞，则要用比现在流动相更强的流动相冲至压力正常。假如按上面的方法长时间冲洗压力都不下降，则可考虑将柱子的进出口反过来接在仪器上，用流动相冲洗柱子。这时，如果柱压仍不下降，只有换柱子入口筛板，但一旦操作不甚，很容易造成柱效下降，所以尽量少用。问题无法解决可考虑更换色谱柱。2、流速设定不正确：可重新设定正确流量。3、流动相配比不正确：不同配比的流动

4、相其黏度系数不相同，较高黏度的流动相相应的系统压力也大，如果可能可更换黏度较小的溶剂或重新设定配比。4、系统压力零点漂移：调节压力传感器的零点。5、阻尼器堵塞：拆下后进行超声波清洗或更换新的阻尼器。6、进样器堵塞：参见说明书清洗。7、管路或连接口堵塞：更换被堵塞管路或按说明书进行清洗。8、柱端过滤器堵塞：拆下过滤器用硝酸超生清洗9、长期使用柱端固定相板结：挖掉板结部分修补柱端10、分析生化、染料等易污染固定相的样品：方法同上, 采用保护柱1.2 压力过低 1、一般是由于系统泄漏，处理方法：寻找各个接口处，特别是色谱柱两端的接口，把泄漏的地方旋紧即可。拆下柱子加适当力拧紧或衬四氟薄膜。2、泵里进

5、了空气，但此时表现的往往是压力不稳，忽高忽低，更严重一点会导致泵无法吸上液体。处理方法：打开 Purge 阀，用 35ml/min 的流速冲洗，如果不行，则要用专用针筒在排空阀处借住外力将气泡吸出。3、无流动相流出：检查储液瓶中有无流动相，沉子是否浸在流动相中，泵是否运行。4、参比阀未关闭：将流速降低后关闭参比阀。一般降至0.10.2mL/min后关闭参比阀。1.3 其它压力问题1、压力传感器故障，柱压升高或降低或无柱压:与供应商联系进行维修。2、系统管路中存在气泡，柱压不稳：重新进行排气操作。( 可重复多次，直至气泡排出)3、沉子表面的小孔被堵塞，柱压在较大范围内波动：将沉子取下后进行超声波

6、清洗。2 基线问题 2.1 基线漂移 基线漂移是色谱工作者普遍遇到的问题,在实际工作中,我们经常能遇到基线漂移的情况,特别是在梯度洗脱的时候,基线漂移是常有的事。一般说来，机器刚起动时，基线容易漂移，大概要 30min的平衡时间，如果你用了缓冲溶液或缓冲盐，还有就是在低波长下（220nm）平衡时间相对会比较长，但如果你在实验过程中发现基线漂移，则你要考虑下面的原因：1、柱温波动 控制好柱子和流动相的温度，检查是否有打开的窗户或空调对着柱温箱。(即使是很小的温度变化都会引起基线的波动。通常影响示差检测器、电导检测器、较低灵敏度的紫外检测器或其它光电类检测器。)控制好柱子和流动相的温度,在检测器之

7、前使用热交换器。2、流通池被污染或有气体 用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池（最好断开柱子） 。如有需要，可以用 1N 的硝酸（不要用盐酸） 。3、紫外灯能量不足 更换新的紫外灯4、流动相污染、变质或由低品质溶剂配成。 检查流动相的组成，使用高品质的化学试剂及 HPLC级的溶剂。5、样品中有强保留的物质（高 K值）以馒头峰样被洗脱出，从而表现出一个逐步升高的基线。 使用保护柱，如有必要，在进样之间。在分析过程中，定期用强溶剂冲洗柱子。6、检测器没有设定在最大吸收波长处 将波长调整至最大吸收波长处7、流动相的 PH 值没有调节好 加适量的酸或碱调至最佳 PH 值8、流动相不均匀: (流动相条件变化

8、引起的基线漂移大于温度导致的漂移。) 使用HPLC级的溶剂,高纯度的盐和添加剂,流动相在使用前进行脱气,使用中使用氦气。9、检测器出口阻塞: (高压造成流通池窗口破裂,产生噪音基线)取出阻塞物或更换管子。参考检测器手册更换流通池窗。10、流动相配比不当或流速变化:更改配比或流速。为避免这个问题可定期检查流动相组成及流速。11、柱平衡慢特别是流动相发生变化:用中等强度的溶剂进行冲洗,更改流动相时,在分析前用1020倍体积的新流动相对柱子进行冲洗。12、使用循环溶剂,但检测器未调整:重新设定基线。当检测器动力学范围发生变化时,使用新的流动相。2.2基线噪音对于紫外检测器, 氘灯光源打开后要预热30

9、 min以上, 基线才能稳定。噪声是指与被测物无关的检测器输出信号的随机扰动变化, 分短期噪声和长期噪声两种。氘灯用的过久, 接近寿命期时 ( 氘灯的寿命约1 000 h) , 会使基线噪音明显增加, 应及时更换氘灯。除光源外, 流路中的气泡也会产生噪音。对于判断基线噪声增大是由于光源灯的老化还是来自流路中的气泡的问题, 可将泵关上, 继续走基线, 如果噪声立即停止 , 基线呈一条直线, 说明基线噪声来自流动相中的气泡, 应设法排气; 若停泵后仍有噪音出现, 应考虑是灯的问题。电化学检测器中的工作电极( 安培型) 对气泡十分敏感, 仪器的平衡时间较长。流路中如果有气泡存在, 不仅基线会出现尖峰

10、, 还会影响检测。因此,做电化学检测时, 流动相的配制要很严格, 水要超纯、除还原物, 配好后一定要过滤脱气, 还应现用现配。如果泵系统不是PK 材料, 即电化学分析专用仪器, 而是普通的高效液相色谱不锈钢泵, 应对系统中的不锈钢材料的输液泵、进样器和管道, 在分析前用6 molL-1 硝酸溶液钝化( 注意断开分离柱) , 可缩短基线平衡时间。还可在流动相中加入EDTA 离子隐蔽剂, 也是可以的。如果有较大的气泡进到检测器中, 光靠泵冲可能太慢, 可暂时将泵停止, 关上电化学检测器, 拆下工作电极 , 用超纯水冲洗电极表面, 也很奏效的, 但对液相色谱技术不太熟练的技术员要小心操作, 不宜反复

11、这样拆卸。2.2.1 基线噪音(规则的)产生基线噪音的原因有：在流动相、检测器或泵中有空气；漏液；流动相混合不完全；温度影响(柱温过高,检测器未加热 )；在同一条线上有其他电子设备 ；泵振动。了避免基线噪音,在正式进样之前,需要对流动相脱气；冲洗系统以除去检测器或泵中的空气；检查管路接头是否松动；泵是否漏液；是否有盐析出和不正常的噪音,如有必要,更换泵密封；用手摇动使溶剂混合均匀或使用低粘度的溶剂减少差异或加上热交换器；有其他电子设备时断开LC、检测器和记录仪,检查干扰是否来自于外部,加以更正；泵振动时在系统中加入脉冲阻尼器。2.2.2 基线噪音(不规则的 )(1) 漏液：检查接头是否松动,泵

12、是否漏液,是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要,更换密封,检查流通池是否漏液。(2) 流动相污染、变质或由低质溶剂配成：检查流动相的组成。(3) 流动相各溶剂不相溶：选择互溶的流动相。(4) 检测器/记录仪电子元件的问题：断开检测器和记录仪的电源,检查并更正。(5) 系统内有气泡：用强极性溶液清洗系统；检测器内有气泡,清洗检测器,在检测器后面安装背景压力调节器。(6) 流通池污染(即使是极少的污染物也会产生噪音 ) :用硝酸清洗流通池;(7) 检测器灯能量时不足更换灯;(8) 色谱柱填料流失或阻塞: 更换色谱柱。(9) 流动相混合不均匀或混合器工作不正常:维修或更换混合器,在流动相不走梯度时,

13、不建议使用泵的混合装置。3 保留时间3.1 保留时间漂移 保留时间的漂移往往由柱老化引起,而柱老化不可能引起保留时间的无规律波动。事实上,保留时间漂移的多半原因是由于不同机理的色谱柱老化,如固定相流失(例如通过水解) ,色谱柱污染( 由样品或流动相所致)等。保留时间漂移的几种最常见的原因和解决方法如下：(1) 色谱柱平衡如果观察到保留时间漂移,首先应考虑色谱柱是否已经平衡。在每一次运行之前给予足够的时间平衡色谱柱。通常平衡需要 1020 个柱体积的流动相,但如果在流动相中加入少量添加剂(如离子对试剂)则需要相当长的时间来平衡色谱柱。流动相污染也可能是原因之一。溶于流动相中的少量污染物可能慢慢富

14、集到色谱柱上,从而造成保留时间的漂移。应注意:水是很容易污染的流动相成分。(2) 固定相稳定性固定相的稳定性都是有限的,即使在推荐的pH 范围内使用,固定相也会慢慢水解。例如,硅胶基质在pH4时水解稳定性最好,水解速度与流动相类型和配体有关。双官能团配体和三官能团配体比单官能团配体的键合相要稳定;长链键合相比短链键合相稳定; 烷基键合相比氰基键合相稳定的多。经常清洗色谱柱亦会加速色谱柱固定相的水解。其他硅胶基质键合相在水溶液环境中也可以发生水解,如氨基键合相等。(3) 色谱柱污染保留时间漂移的另一个常见原因是色谱柱污染。HPLC色谱柱是非常有效的吸附性过滤器,它可以过滤并吸附流动相携带的任何物

15、质。污染源可以是:流动相本身,流动相容器,连接管、泵、进样器和仪器密封垫,以及样品等。通常通过实验可判断污染的来源。样品中如果存在色谱柱上保留很强的组分,就可能是使保留时间漂移的潜在根源。这些根源通常是样品基质,如:配药中的赋形剂,生化样品(如血清) 中的蛋白及类脂类化合物,食品样品中的淀粉,环境水样中的腐殖酸等。通常样品中的强保留组分具有较高的分子量,在此情况下,保留时间漂移的同时或其后会有反压的增加,可以通过使用固相提取( SPE)等样品前处理方法来去除样品基质的影响,避免色谱柱污染最简单的方法是防患于未然。相比之下,找到问题的所在并设计有效的清洗步骤以去除污染物要困难的多。通常使用在给定

16、色谱条件下的强溶剂,但并非所有污染物都可以在流动相中溶解。如THF可去除反相色谱柱中的许多污染物,但蛋白在THF中就不能溶解, DMSO常常用于去除反相色谱柱中的蛋白。使用保护柱是个非常有效的方法。反冲色谱柱仅是不得已时采用的办法。(4) 流动相组成流动相组成的缓慢变化也是保留时间漂移的常见原因。如流动相中易挥发组分的挥发及循环使用流动相等,应防止流动相由于蒸发、反应等等原因造成的变化。(5) 疏水坍塌当小孔径、端基封口良好的反相填料色谱柱使用接近100%的水为流动相时,有时会发生分离突然丧失及被分析物质保留明显降低或完全不保留的现象,这就是疏水坍塌,此现象是由流动相不浸润固定相表面而致。挽救

17、的办法实现用含大量有机组分的流动相浸润固定相,再用高水含量的流动相进行平衡。由是色谱柱长期储存也会发生此现象。使用内嵌极性基团的反相色谱柱(如Waters SymmetryShield RP色谱柱) 或非端基封口的色谱柱(如Waters Resolve色谱柱)也可避免发生坍塌。保留时间重现是液相性能好坏的一个重要标志，同一种东西，两次的保留时间相差不要超过15s，超过了半分钟可看做保留时间漂移，就无法进行定性，你要考虑以下原因：1、温控不当 ：调好柱温，检查是否有打开的窗户或空调对着柱温箱。2、流动相比例变化：检查四元泵的比例阀是否有故障3、色谱柱没有平衡 ：在每一次运行之前给予足够的时间平衡

18、色谱柱4、流速变化 ：重新设定流速5、泵中有气泡 ：从泵中除去气泡6、流量变化：在正确使用流速与流动相的前提下检查泵是否存在问题，比如漏液与在线混合的准确性。7、流动相的问题：使用预混合则要注意每次配液的准确性，精密度与 PH 的变化。有可能是流动相被污染或加入的添加剂对被测组分的干扰。 、8、色谱柱被污染：正/反相冲洗色谱柱或更换新色谱柱。9、梯度滞后时间设置不正确：检查泵和流路系统维护记录，确定很多系统最后使用之前有无调整。如有变化，重新计算新的梯度滞后体积。10、色谱柱使用问题：不同的色谱柱尺寸与填料对同一物质的保留时间是不同的。同一批样品的分析最好使用同一色谱柱。11、系统不平衡：应该

19、用充足的时间来平衡整个系统，特别在色谱柱第一次使用离子对试剂时，要有充足时间和流动相体积来平衡色谱柱。每次开机使用时平衡时间至少为0.51h，在改变流动相时也需要0.5h来重新平衡柱子。3.2 保留时间波动保留时间有的缩短,有的延长,有的上下波动,保留时间波动的主要原因： 色谱柱温度范围控制的不好,温度波动太大；流动相当中组分发生变化；色谱柱没有平衡；流动相流速发生变化；泵中有气泡；流动相选择不恰当等。解决办法：严格控制柱子的温度,室内温度保持恒定,上下波动二度为宜；流动相的组成恒定,防止变化(蒸发、反应等) ；色谱柱在每一次运行之前给予足够的时间平衡；选择合适的流动相或者混合流动相,并使流速

20、保持恒定,发生变化时重新设定流速；管线内有气泡时要用脱气机进行脱气并时时监控保持。4 峰型异常问题峰型问题是液相的主要问题，在做液相过程中，我们就是要变换不同的条件来改善不好的峰型，对于各种各样的异常峰，要区别对待，从主要问题出发，一个一个加以解决。1、色谱图中未出峰 系统未进样或样品分解；泵未输液或流动相使用不正确；检测器设置不正确；针对以上情况成因作相应调整即可。2、 一个峰或几个峰是负峰 流动相吸收本底高；进样过程中进入空气；样品组分的吸收低于流动相。3、 所有峰均为负峰 信号电缆接反或检测器输出极性设置颠倒；光学装置尚未达到平衡。4、所有峰均为宽峰 系统未达到平衡；溶解样品的溶剂极性比

21、流动相差很多；色谱柱尺寸及类型选择不正确；色谱柱或保护柱被污染或柱效降低；温度变化造成的影响。 、5、所出峰比预想的小 样品黏度过大；进样品故障或进样体积误差；检测器设置不正确定量环体积不正确；检测池污染；检测器灯出现问题。6、出现双峰或肩峰 进样量过大；样品浓度过高；保护柱或色谱柱柱头堵塞；保护拄或色谱柱污染或失效；柱塌陷或形成短通道。 7、前伸峰：进样量或样品浓度高，溶解样品的溶剂较流动相极性强；保护柱或色谱柱污染或失效。柱温低：升高柱温；样品溶剂选择不恰当：使用流动相作为样品溶剂；样品过载：降低样品含量；色谱柱损坏：更换柱子。8、拖尾峰：柱超载，降低样品量；增加柱直径采用较高容量的固定相

22、；峰干扰，对样品进行清洁过滤；调整流动相；硅羟基作用，加入三乙胺，用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相pH 值；柱内烧结不锈钢失效，更换烧结不锈钢；加在线过滤器，对样品进行过滤；死体积或柱外体积过大，将连接点降至最低；尽可能使用内径较细的连接管；柱效下降，更换柱子；采用保护柱，对柱子进行再生。色谱峰拖尾是色谱分析中最常见问题之一。产生的原因很多,早期的液相色谱柱由于封尾技术原因,硅胶基质上的硅羟基残留多,被分析物与色谱柱间的相互作用导致峰拖尾, 认为是残留硅羟基与分析物中的游离氨基与硅羟基的氢键作用力的结果。峰拖尾一般发生在碱性化合物上,这是由于残留的硅羟基和带正电荷的碱性化合物之间的相

23、互作用引起的。这也是许多有机含氮药物色谱峰拖尾的原因,解决这类药物拖尾的方法有加入扫尾剂、磷酸盐、或者加入离子对试剂。一般可以得到有效的解决。当流动相的值大于4. 55. 0时, 色谱柱表面的硅羟基会带负电荷,因此,消除峰拖尾的最有效方式是使用pH 值小于4的缓冲流动相。由于硅羟基的活性和离子化会降低,因此选择更换新的高纯羟基化硅胶色谱柱也会减少峰拖尾。目前色谱填充技术已相对成熟,许多色谱柱甚至可以达到硅羟基的完全封尾但是对很多药物色谱拖尾仍然非常严重,因此硅羟基作用力只是造成色谱峰拖尾的可能原因之一。9、出现平头峰 检测器设置不正确；进样体积太大或样品浓度太高。10、出现鬼峰 进样阀残余峰，

24、可能为上次样品的残余。在每次进完样后用充足的时间来平衡和清洗系统；样品中存在未知物，改进样品的预处理；流动相污染，更换新流动相，尽可能现配现用，隔夜的流动相再次使用时要过滤；尽可能使用HPLC级试剂；流路中有小的气泡，打开Purge阀，加大流速排除。11、峰分叉 保护柱或分析柱污染：取下保护柱再进行分析,如果必要更换保护柱。如果分析柱阻塞,拆下来清洗。如果问题仍然存在,可能是柱子被强保留物质污染,运用适当的再生措施。如果问题仍然存在,入口可能被阻塞,更换筛板或更换色谱柱。样品溶剂不溶于流动相改变样品溶剂,如果可能采取流动相作为样品溶剂。12、峰变形 样品过载，减少样品载量。13、早出的峰变形

25、样品溶剂选择不恰当 减少进样体积 运用低极性样品溶剂14、早出的峰拖尾程度大于晚出的峰 柱外效应 调整系统连接(使用更短、内径更小的管路)使用小体积的流通池15、K增加时,拖尾更严重（1）二级保留效应,反相模式加入三乙胺(或碱性样品)加入乙酸(或酸性样品)加入盐或缓冲剂(或离子化样品)更换一支柱子（2）二级保留效应,正相模式加入三乙胺(或碱性样品)加入乙酸(或酸性样品)加入水( 或多官能团化合物)试用另一种方法（3）二级保留效应,离子对 加入三乙胺(或碱性样品)16、酸性或碱性化合物的峰拖尾 缓冲不合适使用浓度50100 mM的缓冲液使用Pka等于流动相pH值的缓冲液17、额外的峰 （1）样品

26、中有其他组分：正常现象；（2） 、前一次进样的洗脱峰：增加运行时间或梯度斜率提高流速；（3）空位或鬼峰：检查流动相是否纯净 使用流动相作为样品溶剂 减少进样体积。5 结语以上内容只是对液相色谱中出现的常见的问题进行了分析，当然在我们实际应用当中还会遇到更多的其它问题，在故障排除时要遵守以下原则：一次只改变一个因素，确定假定因素与问题之间的联系；如果通过更换组件来排查故障时要注意将拆下的完好组件装回原位，避免浪费；养成良好的记录习惯，这是成功进行故障排除的关键。总之，在使用高效液相色谱时一定要注意样品的前处理与仪器的正确操作和保养。输液泵的常见故障及对策输液泵/ 高压泵是保证HPLC 系统流路畅

27、通、流量精确和压力稳定的重要仪器部件, 目前多用往复式恒流柱塞泵, 主要由柱塞杆、密封垫圈和两个单向阀组成, 用马达带动凸轮驱动柱塞杆作吸液和排液的往复运动。常分为单柱塞泵、并联柱塞泵、串联柱塞泵和柱塞隔膜泵等类型。流动相混合方式分为低压混合和高压混合。常见泵的故障主要有以下几种, 并提供解决的办法。1 单向阀故障由于球与阀座密封不严, 液体倒流,造成压力不稳, 甚至球与阀座粘在一起阻死。密封不严主要是污染或气泡引起, 球与阀座粘连也是由于污染和磨损造成。为避免单向阀中的宝石球和阀座被污染, 流动相应使用HPLC 级的溶剂, 并且配好的流动相一定要用0.45u滤膜过滤和脱气。如果泵被微粒污染,

28、 可分别用水、甲醇、异丙醇、二氯甲烷依次冲洗。冲洗时应打开泄液阀,最后再用所用的溶液冲洗整个系统。气泡进入阀中会紧贴在阀体的一侧, 使宝石球难返回到阀座, 引起倒流, 泵的压力和流速会明显改变。此时, 应立即打开泄液阀 , 大流量( 2ml/min) 冲洗泵, 直至排除液为直线型。因为甲醇可润湿泵内壁, 挤出气泡, 故也可使用脱过气的甲醇冲洗泵。长期不用的泵或新装的泵头应该用甲醇赶气泡。泵进气泡也可在泵头上排气泡, 即用扳手固定住进气泡的泵头, 拧开输出管道的压帽, 手动泵送液, 可见到气泡从孔中挤压出来, 直至无气泡排出将压帽拧紧3。采取上述办法仍不能使压力稳定, 应考虑是否密封垫坏了? 或

29、单向阀磨损、球不光滑等, 需更换部件。2 泵垫圈故障泵垫圈常见的故障是渗漏和垫圈受损污染系统。液相色谱系统一般情况下不要使用强酸强碱溶液, 因为这会损坏密封垫和柱塞杆。密封垫圈与运动着的柱塞杆紧密接触, 可使柱塞在泵头自由运动而流动相不漏出来, 它是液相色谱系统中最易磨损的部件。有条件的实验室可三个月更换一次垫圈, 防止泵系统污染。如果用缓冲盐作流动相则更会加速垫圈的磨损, 应及时冲洗。当垫圈损坏时, 表现为: 泵压力不稳、泵头漏液。一旦出现这个现象, 应尽快更换新垫圈。为避免上述故障的发生, 我们在分析工作中应注意以下几点: 使用超纯水( 18M.cm) 、纯度级别较高的试剂和色谱级溶剂配制

30、流动相; 配好的流动相一定要抽滤脱气, 即便仪器有在线脱气装置, 也最好在上机前进行抽滤。真空抽滤既过滤颗粒也脱了气泡, 非常有效。 泵在起动前一定要通过泄液阀抽净泵里的空气。 用缓冲盐洗脱时, 分析结束后一定要用水冲洗泵和整个流路系统, 不要让腐蚀性溶液滞留泵中, 最后用有机溶剂充满系统。色谱分离柱的使用与维护在前述仪器工作原理部分, 我们已经指出, 液相色谱仪的分离是在色谱分离柱中实现的。我们目前工作中多采用反相色谱柱, 如何保护好分离柱减少柱的污染是延长柱寿命的关键。1 怎样维护好色谱分离柱加保护柱( 预柱) 是保护分离柱的有效办法。保护柱是根内装填料与分离柱性质相近的短柱, 接在分离柱

31、之前, 或代替流路过滤器。保护柱的作用是收集和阻塞分离柱口的化学垃圾, 这些垃圾如果直接进入分离柱会逐渐堆积在柱头, 最终降低柱效能。保护柱是消耗品, 如分析血浆样品, 一般分析50 个样品后需更换新柱芯。避免高压冲击分离柱。一般色谱柱都能承受得起高压, 但经不住突然变化的高压冲击, 这将改变柱床体积,影响柱效。引起高压冲击的原因主要有: 进样器的样品阀的缓慢转动、泵启动太快、柱切换等操作。用手动进样阀时的压力变化不大, 自动进样阀由于切换较慢, 可能会造成压力冲击。合理选择分离柱。我们知道, 选择色谱分离柱主要根据两点, 一是根据待测组分的分子量的大小; 二是根据流动相条件, 包括PH 值、

32、离子强度和溶剂极性等。传统硅胶基质的键合相柱要求流动相PH 值在3- 7 之间,极端PH 值( 8) 的流动相能溶解硅胶, 使键合相流失。而目前利用先进的杂化颗粒技术研制的高纯硅胶颗粒填料( 如Waters 公司的XTerra 色谱柱) , 集硅胶和多孔聚合物填料的优点为一体, 使有机硅烷单元取代了相当一部分占据颗粒内部和表面位置的硅羟基, 使这种新型填料具有分辨率高、稳定性强、PH 范围宽( 1- 12) 的优势, 其性能突破了传统高效液相色谱柱的极限。所以一定要根据分析的对象、流动相的条件选择合适的分离柱, 茫然时可向公司的技术人员咨询。定期冲洗分离柱。每次分析工作结束时, 冲洗完缓冲盐后

33、, 最后要过度到用强溶剂冲洗柱子, 如可用色谱纯甲醇、乙腈冲洗反相C18 柱, 目的是冲去吸附在柱上的强保留组分。如果用甲醇/ 水为流动相也应这样冲洗柱子, 在一定程度上可恢复柱效。2 怎样减少柱的污染?最有效的办法是纯化样品。我们在多年的分析工作中发现, 凡是样品纯化的越干净, 分离柱的寿命就越长;反之, 只有提取没有纯化的样品, 分离柱柱效下降较快。建立一个理想的色谱分析方法应该有一套有效的样品前处理方法, 特别是在分析血浆和尿液样品时, 要特别注意样品的提取与纯化, 尽量使处理过的样品中杂质( 如大分子蛋白、有机物等) 降到最低, 保护柱头和柱子。提取纯化好的样品最好用流动相来溶解, 一

34、方面减少色谱图中的溶剂峰干扰, 另一方面也是检查样品在流动相中的溶解性, 如果样品进样后在流动相中沉淀, 会堵塞进样器和柱头, 甚至样品分解, 出现怪峰。如果出现样品与流动相不溶要设法改变溶解条件, 如更换样品溶剂, 或改进处理样品的方法, 或过滤, 去除不溶性物质。检测器的常见故障及对策液相色谱仪常用的检测器主要有紫外、荧光和电化学检测器。这些检测器的作用就是收集流经色谱分离柱的各组分在检测器中的信号, 根据组分光吸收值/ 荧光强度/ 电极表面电流的变化计算出组分的浓度4。各检测器常见故障主要有:1 基线噪音较大和对策对于紫外检测器, 氘灯光源打开后要预热30 分钟以上, 基线才能稳定。氘灯

35、用的过久, 接近受命期时( 氘灯的寿命约束1000 小时) , 会使基线噪音明显增加, 应及时更换氘灯。除光源外, 流路中的气泡也会产生噪音。怎样判断基线噪音增大是由于光源灯的老化还是来自流路中的气泡?可将泵关上, 继续走基线, 如果噪音立即停止, 基线呈一条直线, 说明基线噪音来自流动相中的气泡, 应设法排气; 若停泵后仍有噪音出现, 应考虑是灯的问题。电化学检测器中的工作电极( 安培型) 对气泡十分敏感, 仪器的平衡时间较长。流路中如果有气泡存在, 不仅基线会出现尖峰, 还会影响检测。因此, 做电化学检测时, 流动相的配制要很严格, 水要超纯、除还原物, 配好后一定要过滤脱气, 还应现用现

36、配。如果泵系统不是PK材料, 即电化学分析专用仪器, 而是普通的高效液相色谱不锈钢泵, 应对系统中的不锈钢材料的输液泵、进样器和管道, 在分析前用6mol/L 硝酸溶液钝化( 注意断开分离柱) , 可缩短基线平衡时间。还可在流动相中加入EDTA 离子隐蔽剂, 也是可以的。如果有较大的气泡进到检测器中, 光靠泵冲有时太慢, 可暂时将泵停止, 关上电化学检测器, 拆下工作电极, 用超纯水冲洗电极表面, 也很奏效的, 但对液相色谱技术不太熟练的技术员要小心操作, 不宜反复这样拆卸。2 检测器污染及对策管道污染阻塞是检测器常见故障。当流动相用了缓冲盐更换流动相又不当时, 常会在检测器管路中产生沉淀,

37、可先用5 倍柱积的水冲洗, 再用10 倍柱积的强溶剂( 如乙腈) 流过, 再用50 倍的柱体积的异丙醇冲洗, 最后换上反相流动相平衡。当检测器管路堵塞时, 可表现为柱压升高, 此时, 应和柱头堵塞相区分。可断开柱子,直接接检测器, 如泵压仍较高, 可判断压力升高是由于检测器管道堵塞造成。检测器进口是常发生阻塞的地方, 正向冲洗效果常不明显, 我们的经验是将检测器进出口管道对调, 用6mol/L 硝酸溶液反冲检测器, 能很快将阻塞冲开, 但要注意用低流速冲洗, 观察压力变化。检测池阻塞和污染多见紫外检测器。池阻塞也可用上述方法反冲, 一般都能疏通。通常, 池阻塞的故障比较少见, 而池污染常发生,

38、 如不干净的样品在池窗上积聚等, 都会造成检测池污染。表现为基线噪音增大, 仪器灵敏度下降。可用注射器依此回抽异丙醇、6mol/L 硝酸, 要小心操作, 将池中的污物冲洗干净, 最后用100ml 纯水正向冲洗检测池。反向冲洗还可防止池渗漏。对于电化学检测器, 要注意维护工作电极表面的清洁度, 当检测器检测了大量较脏的样品( 如血浆、尿液) 或用的过久, 应用化学法或物理抛光法对电极表面进行清洁, 可提高一定的检测灵敏度, 但要注意, 最后一定要用纯水冲洗干净, 不要带来其它污染。高效液相色谱仪的保养1、高效液相色谱的工作条件温度：1030C；相对湿度80%；最好是恒温、恒湿，远离高电干扰、高振

39、动设备。2、泵的保养1)使用流动相尽量要清洁，流动相要过滤后再用；2)进液处的沙芯过滤头要经常清洗；3)流动相交换时要防止沉淀；4)避免泵内堵塞和进入气泡;3、进样器的保养每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污染。4、柱的保养1) 柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动；2) 当柱子和色谱仪连接时，连接处和管路一定要清洗干净；3)流动相一定要脱气后再使用；4)避免使用高黏度的溶剂作为流动相，同时要避免使用强酸强碱做流动相；5)待分析样品要过滤、纯化；6)严格控制进样量；7) 每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品；8) 每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗色谱柱；9) 若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存柱子并将其封闭；5、检测器(UV )的保养 1)紫外灯的保养：在分析前，柱平衡得差不多时，打开检测器；在分析完成后，马上关闭检测器，减少紫外灯的使用。2) 分析完后，样品池要严格进行清洗。6 、对整套仪器的保养对经常使用的仪器要按以上操作对各部件进行维护与保养。对常期不用的仪器要定期开机运行，最好每周开机2h 左右，以便对其性能及潜在问题能及时了解。