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植物9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶NCED酶联免疫分析.DOC

1、 植物 9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶 (NCED)酶联免疫 分析 试剂 盒使用说明书 本试剂盒仅供研究使用 。 检测范围: 96T 12 U/L -450U/L 使用目的: 本试剂盒用于测定 植物 组织,细胞及其它相关样本中 9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED)活性 。 实验原理 本试剂盒应用双抗体夹心法测定 标本 中 植物 9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶 (NCED)水平。用纯化的 植物 9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧 酶 (NCED)抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入 植物 9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶 (NCED), 再与 HRP 标记的 9-顺式环氧类胡萝

2、卜素双加氧酶 (NCED)抗体结合,形成抗体 -抗原 -酶标抗体复合物 ,经过彻底洗涤后 加 底物 TMB 显色。 TMB 在 HRP 酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的 植物 9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶 (NCED)呈正相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度( OD 值), 通过标准曲线 计算样品 中 植物 9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶 (NCED)活 性 浓度。 试剂盒组成 1 30 倍浓缩洗涤液 20ml 1 瓶 7 终止液 6ml 1 瓶 2 酶 标试剂 6ml 1 瓶 8 标准 品 ( 800U/L) 0.5ml 1 瓶 3 酶

3、标包被 板 12 孔 8 条 9 标准品 稀释液 1.5ml 1 瓶 4 样品 稀释液 6ml 1 瓶 10 说明书 1 份 5 显色剂 A 液 6ml 1 瓶 11 封板膜 2 张 6 显色剂 B 液 6ml 1/瓶 12 密封袋 1 个 标本 要求 1标本采集后尽早进行 提取,提取按相关文献进行,提取后应尽快进行 实验。 若不能马上进行试验,可 将标本放于 -20 保存,但 应 避免反复冻融 2不能检测含 NaN3 的样品 ,因 NaN3 抑制辣根过氧化物酶的( HRP)活性。 操作步骤 1. 标准品的稀释: 本试剂盒提供原倍标准品一支,用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。 400U/L

4、 5 号标准品 150l 的原倍标准品加入 150l 标准品稀释液 200U/L 4 号标准品 150l 的 5 号标准品加入 150l 标准品稀释液 100U/L 3 号标准品 150l 的 4 号标准品加入 150l 标准品稀释液 50U/L 2 号标准品 150l 的 3 号标准品加入 150l 标准品稀释液 25U/L 1 号标准品 150l 的 2 号标准品加入 150l 标准品稀释液 2. 加样:分别设空白孔 (空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同) 、 标准孔、待测样品孔 。 在酶标 包被板上 标准品准确加样 50l, 待测样品孔中 先加样品稀释液 40l,然后再加待测

5、样品 10l(样品最终稀释度为 5 倍)。 加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁, 轻轻 晃动 混 匀 。 3. 温育:用封板膜封板后置 37 温育 30 分钟 。 4. 配液: 将 30 倍浓缩洗涤液用蒸馏水 30 倍稀释后备用 5. 洗涤:小心揭掉封板膜, 弃去液体, 甩干 ,每孔加满洗涤液,静置 30 秒后弃去,如此重复 5 次,拍干。 6. 加酶:每孔加入酶标试剂 50l,空白孔除外 。 7. 温育:操作同 3。 8. 洗涤:操作同 5。 9. 显色:每孔先加入显色剂 A50l,再加入显色剂 B50l,轻轻震荡混匀, 37 避光显色15 分钟 . 10. 终止: 每孔加终止 液

6、50l, 终止反应 (此时蓝色立转黄色) 。 11. 测定:以空白空调零, 450nm 波长依序测量各孔的 吸光 度( OD 值) 。 测定应 在加终止液后 15 分钟以内进行 。 操作程序总结: 计算 以标准物的浓度为横坐标, OD 值为纵坐标,在 坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的OD 值由标准曲线查出相应的浓度;再乘以 稀释倍数 ;或用标准物的浓度与 OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式,将样品的 OD 值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以 稀释倍数 ,即为样品的实际浓度。 注意事项 1 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡 15-30 分钟后方可使用,酶标包被板开封后如未用完,板条应装入

7、密封袋中保存。 2 浓洗涤液 可能 会有 结晶 析出,稀释时可在水 浴中加温助溶 ,洗涤时不影响结果。 3 各步加样均应使用加样器,并经常校对其准确性,以避免试验误差。一次加样时间最好控制在 5 分钟内,如标本数量多,推荐使用排枪加 样。 4 请每次测定的同时做标准曲线,最好做复孔。如标本中待测物质含量过高 (样本 OD 值大于标准品孔 第一孔的 OD 值 ) ,请先 用样品 稀释 液稀释一定倍数( n 倍) 后再测定,计算时请最后 乘以 总 稀释倍数 ( n 5) 。 5 封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。 6底物请避光保存。 7 严格按照说明书的操作进行, 试验结果判定必须以酶标仪读数为准 . 8所有样品,洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。 9本试剂不同批号组分不得混用。 保存条件及有效期 1 试剂盒保存: ; 2-8 。 2有效期: 6 个月

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