表达载体的构建方法及步骤.doc

1、表达载体的构建方法及步骤一、载体的选择及如何阅读质粒图谱 目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒 DNA 是一种新的非病毒转基因载体。一个合格质粒的组成要素：（1）复制起始位点 Ori 即控制复制起始的位点。原核生物 DNA 分子中只有一个复制起始点。而真核生物 DNA 分子有多个复制起始位点。（2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如 Amp+ ,Kan+（3）多克隆位点 MCS 克隆携带外源基因片段（4） P/E 启动子/ 增强子（5）Terms 终止信号（6）加 poly（A）信号可以起到稳定 mRNA 作用选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建

2、的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。载体选择主要考虑下述 3 点：【1】构建 DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。【2】.载体的类型：（1）克隆载体的克隆能力据克隆片段大小（大选大，小选小）。如10kb 选质粒。（2）表达载体据受体细胞类型原核/真核/穿梭， E.coli/哺乳类细胞表达载体。（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服 4 个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。【3】载体 MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能

3、产生阅读框架错位。综上所述，选用质粒（最常用）做载体的 5 点要求：（1）选分子量小的质粒，即小载体（11.5kb ）不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；（2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般 10 个以上的拷贝，而严谨型质粒10 个。（3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；（4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位 Ampr（试一试）。（5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如 Puro、G418）等等。无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体 DNA 进

4、行切割，获得线性载体分子，以便于与目的基因片段进行连接。如何阅读质粒图谱第一步：首先看 Ori 的位置，了解质粒的类型（原核/真核/ 穿梭质粒）第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。（1）Ampr 水解 内酰胺环，解除氨苄的毒性。（2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。（3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。（4）neor（ kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使 G418（长那霉素衍生物）失活（5）hygr 使潮霉素 失活。第三步：看多克隆位点（MCS）。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。如果在这些酶切位点以外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而

5、便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。第四步：再看外源 DNA 插入片段大小。质粒一般只能容纳小于 10Kb 的外源 DNA 片段。一般来说，外源 DNA 片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。第五步：是否含有表达系统元件，即启动子核糖体结合位点克隆位点转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。第六步：启动子核糖体结合位点克隆位点转录终止信号（1）启动子促进 DNA 转录的 DNA 序列，这个 DNA 区域常在基因或操纵子编码序列的上游，是 DNA 分子上可以与 RNApol 特

6、异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。（2）增强子/沉默子为真核基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。/沉默子负增强子，负调控序列。（3）核糖体结合位点/起始密码/SD 序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA 有核糖体的两个结合位点，对于原核而言是 AUG（起始密码）和 SD 序列。（4）转录终止序列（终止子）/翻译终止密码子：结构基因的最后一个外显子中有一个 AATAAA 的保守序列，此位点 down stream 有一段 GT 或 T 富丰区，这 2 部分共同构成 p

7、oly（A）加尾信号。结构基因的最后一个外显子中有一个 AATAAA 的保守序列，此位点 down stream 有一段 GT 或 T 富丰区，这 2 部分共同构成 poly（A）加尾信号。质粒图谱上有的箭头顺时针有的箭头逆时针，那其实是代表两条 DNA 链，即质粒是环状双链 DNA，它的启动子等在其中一条链上，而它的抗性基因在另一条链上 .根据表达宿主不同，构建时所选择的载体也会不同。二、目的基因的获得 一般来说，目的基因的获得有三种途径：调取基因：根据目的基因的序列，设计引物从含有目的基因的 cDNA 中通过PCR 的方法调取目的基因，链接到克隆载体挑取单克隆进行测序，以获得想要的基因片段

8、，这种方法相对成本较低，但是调取到的基因往往含有突变，还有不同基因的表达丰度不同，转录本比较复杂，或是基因片段很长，这些情况都很难调取到目的基因。全基因合成：根据目的基因的 DNA 序列，直接设计合成目的基因。此方法准确性高，相对成本会高一些，个人操作比较困难，需要专业的合成公司完成。优点是可以合成难调取及人工改造的任何基因序列，同时可以进行密码子优化，提高目的基因在宿主内的表达量。三、克隆构建 目前，克隆构建的方法多种多样，除了应用广泛的酶切链接以外，现在还有很多不依赖酶切位点的克隆构建方式。下面具体说一下双酶切方法构建载体的步骤。实验材料实验试剂试剂名称 生产厂家载体 pCDNA3.1 T

9、ransheep大肠杆菌菌株 DH5 Tiangen 限制性内切酶 FermentasT4 连接酶 Fermentas质粒 DNA 小,大量抽提试剂盒 Axygen 凝胶回收试剂盒 Axygen琼脂糖 BiowestDNA ladder Fermentas（2）X 基因慢病毒载体的构建X 基因基因由 Transheep 全基因合成，构建于载体 PUC57 中。PUC57-X 基因 EcoRI/BamHI 酶切结果：酶切完成后进行胶回收2. 载体用 pCDNA3.1 双酶切，酶切体系如下。20ul 酶切体系 37 度 3 小时4ul pCDNA3.1 载体（500 ng/ul）1ul BamHI

10、1ul EcoRI2ul 10buffer 12 ul H2O酶切完成后胶回收（见附录）处理好的目的片段与载体连接反应体系：6ul PCR 酶切回收片段（约 50ng/ul）1ul 酶切好的载体（约 50ng/ul）2ul ligase buffer1ul T4ligase10ul H2O以上连接液在 16过夜。转化 (感受态细胞 : DH5a),具体步骤见附录转化部分。抗性: Amp; 37，培养过夜转化后 X 基因分别平板挑菌, 37 250 转/分钟摇菌 14 小时，PCR 鉴定后，将阳性菌液送上海权阳生物技术有限公司测序。X 基因慢病毒载体单克隆菌落 PCR 鉴定（使用载体通用引物,PCR 条带大小应比实际大 200bp 左右）：