毕业论文内容要求模板丹参的研究.docx

1、 I 摘 要 丹参（ Salvia miltiorrhiza Bunge） ， 为唇形科鼠尾草属 多年生直立草本 植物， 其根和根茎皆可入药，具有祛瘀止痛，活血通经，清心除烦等功效。近年来 随着 丹参 需求的日益扩大 ， 野生资源的逐渐减少， 人工种植品种退化及病虫灾害等一系列问题的产生，导致丹参产量和质量的逐年降低。因此，有效 提高丹参 中 活性成分的含量、培育优质新品种已成为丹参 现代化 开发 利用的必由之路 。丹参中主要次生代谢产物分为两大类：一类为水溶性的酚酸类化合物 ；另 一类为脂溶性的丹参酮类物质 。基于 传统中药 多 以水煎服的 用 药方式，水溶性 的 酚酸类成分被认为是丹参发挥

2、药效的活性物质 。研究报道丹参中主要的 酚酸类活性成分生物 主要源于 酪氨酸代谢途径 和 苯丙烷类代谢途径 ，多为咖啡酸的衍生物，并且其合成受到一些 MYB 和 BHLH 类转录因子的调控。鉴于此， 本论文在已有研究的基础上， 选取丹参 -基因 为研究对象， 克隆 其 启动子 序列并 进行序列 的生物信息学 分析 ，探究其潜在的表达调控模式， 为更好地研究丹参 -基因 的功能及在丹参酚酸类合成中的作用奠定基础。 1.利用 PCR 的方法从丹参 gDNA 水平克隆得到了 -基因的 启动子序列 ，该 序列 全长 -bp。 2.利用启动子在线分析软件进行启动子顺式作用元件分析 。分析结果显示，该 基

3、因 启动子区域上分布有与生物或非生物胁迫相关的顺式作用元件如 -、-、 -等，以及与激素响应相关的顺式作用元件 -、 -等。 关键词：丹参， -基因 ,启动子， 顺式作用元件。 Abstract 第 1 章 引言 1 第 1 章 引言 1.1 丹参的研究概况 丹参（ Salvia miltiorrhiza Bunge） ，又名赤参、逐乌、郁蝉草、奔马草等， 为唇形科鼠尾草属 多年生直立草本 植物， 产河北，山西，陕西，山东，河南，浙江，江苏，安徽，江西及湖南等地，生于海拔 120 1300 米的山坡、林下草丛或溪谷旁 1。根和根茎可入药，味苦，微寒。归心，肝经。具有祛瘀止痛，活血通经，清心除烦

4、的功效。在临床上广泛用于用于月经不调，经闭痛经，胸腹刺痛，热痹疼痛，疮疡肿痛，心烦不眠，肝脾肿大，心绞痛等症的治疗 2。 丹参具有种植条件简单、繁殖周期短、即能杂交授粉又能自交授粉 3、次生代谢产物丰富，主要化学成分明晰 4,5,6，基因组相对小 7、基因操作技术成熟简便 8-10等优点。是研究药用植物次生代谢产物生物合成及调控的理想材料。因此具有 “药用模式植物 ”之称 11-13。 丹参为 我 国 十大大宗药材之 首， 年需求量 超万 吨 ， 仅原药材生产销售额达数亿元 人民币，现已上市的 中成药 和 复方制剂 达百余种，总产值 超过 100 亿元 11。 1.1.1 丹参主要化学成分及其

5、药理作用 对丹参活性成分的研究始于二十世纪三十年代。依据已分离化合物的 特 征和理化性质，将其分为两类： 脂溶性丹参酮类化合物 与 水溶性酚酸类化合物 4,5,6。（ 图1-1）。自 1934 开始， 已分离鉴定的丹参脂溶性化合物达 40 余种，主要包括丹参酮I、 IIA、 IIB 、 V 、 VI，异丹参酮 I、 II 、 IIB，隐丹参酮，异隐丹参酮，丹参新醌A、 B、 C 、 D，二氢异丹参酮 、丹参酮二酚、丹参环庚三烯酚酮等 14。其中，丹参酮 A 是丹参治疗冠心病的主要成分之一，具有扩张冠状动脉、抗血小板凝集、清除氧自由基、改善记忆力障碍等作用 ， 被 2010 年版中华人民共和国药

6、典规定为丹参药材质量控制的指标成分之一；隐丹参酮具有强抗菌性， 并对治疗心肌缺血也有一定的疗效 ，是丹参抗菌消炎类制剂的质量控制指标 2,15-17。对丹参水溶性成分的相关研究始于 20 世纪 70 年代，至今已分离鉴定了咖啡酸、迷迭香酸，迷迭香酸甲酯，丹酚酸 A、 B、 C 、 D、 E、 F 、 G， 原儿茶醛，原儿茶酸，紫草酸，丹参素，异阿魏酸，紫草酸单甲酯，紫草酸二甲酯， 紫草酸乙酯等 20 多种陕西师范大学硕士学位论文 水溶性的酚酸类物质 4,18-19（图 1-1）。丹参水溶性酚酸类成分主要表现为抗氧化作用 20。丹酚酸 B 是目前发现的抗氧化作用最强的天然产物之一，也是丹参中含量

7、最高的酚酸类化合物，对心、脑、肝、肾、胃等多个器官具有保护作用，被 2010年版中华人民共和国药典规定为丹参药材质量控制的水溶性指标性成分之一；迷迭香酸具有抗炎镇痛作用；丹参素和原儿茶醛是治疗冠心病的有效成分 2,20-23。鉴 于 传 统 中药以水煎服 的 用药方式， 丹参水溶性化合物 受到 人们 越来越多的关注。 除 上所述化合物，丹参中还含有微量的鼠尾草酚、弥罗松酚、黄芩苷、熊果酸、柳杉酚、琥珀酸和 -谷甾醇 -D-葡萄糖苷等化学成分。 图 1-1 丹参酚酸类化合物的结构 Figure 1-1 Structures of the phenolic acids of S. miltiorr

8、hiza 1.1.2 丹参资源利用的现状 随着对丹参有效成分及药理作用的深入研究，近年来以丹参为主要原材料的产品不断被推出，丹参的需求量越来越多。 丹参野生资源的采挖力度加大，同时人工种植面积也在不断增加。但是，丹参作为异交植物，其种内变异非常大，性状也很复杂。因此只注重扩大栽培面积而忽略其优良品种选育导致了丹参品种严重退化，质量不均一，有效成分含量降低等诸多问题，从而影响了丹参 大规模进军国际市场 24-25。 另外，人工栽培条件下药田生态环境中生物多样性差、丰富度低，导致丹参病虫害优势种群突出、病虫害频发 等问题也 严重影响了药材的产量和质量 26,27。 因此 为了提高 丹参 品质， 更

9、好的 满足 市场需求，近年来利用基因工程、 细胞工程等现代生物技术手段对丹参进行改良 ， 筛选优异丹参资源 ， 提高丹第 1 章 引言 3 参药材有效成分的含量愈来愈受到人们的重视 。 1.2 丹参酚酸类物质的合成 1. 2.1 丹参酚酸类成分生物合成途径的研究概况 迷迭香酸在多种唇形科植物中均有发现，迷迭香酸生物合成相关酶基因已经研究的较为清楚。咖啡酸和丹参素等几种单苯环物质可由氨基酸直接氧化脱氨生成， 其余均可视为咖啡酸与丹参素酯化缩合反应 产物 。 丹参素源于酪氨酸代谢途径，咖啡酸来 自 苯丙烷类代谢途径，迷迭香酸是由酪氨酸代谢途径和苯丙烷类代谢途径共同参 合 成 的。 酪氨酸代谢途径中

10、的羟基苯丙酮酸还原酶（ HPPR） 与 酪氨酸氨基转移酶（ TAT）参与了丹参素的合成；迷迭香酸合酶（ RAS）、苯丙烷类代谢途径中的苯丙氨酸解氨酶（ PAL）、肉桂酸 -4-羟化酶（ C4H）和 4-香豆素辅酶 A连接酶（ 4CL）以及酪氨酸代谢途径中的 TAT 和 HPPR 共同参与了迷迭香酸及 丹酚酸 B 的生物合成过程 28-29。 丹参酚酸类化合物的生物合成途径分为三部分。第一部分：莽草酸途径，由葡萄糖经 多步酶促反应生成莽草酸，进而形成芳香族氨基酸苯丙氨酸和酪氨酸，它们是连接初生代谢和次生代谢的关键。第二部分：酪氨酸代谢和苯丙烷主干代谢两条互相平行的途径，苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶(

11、PAL） 催化作用下生成肉桂酸，肉桂酸在细胞色素 P450 单加氧酶 CYP73 亚家族的肉桂酸 - 4- 羟化酶 (C4H） 和 4- 香豆素辅酶 A 连接酶 (4CL)的催化下生成 4- 香豆酰 CoA ，是植物酚酸、黄酮类和木质素类物质合成的通用途径；酪氨酸经由酪氨酸氨基转移酶（ TAT ）和羟苯基丙酮酸还原酶（ HPPR）的催化合成丹参素。第三部分：丹参酚酸类物质的特异合成途径，以 4-香豆酰辅酶 A 和 4-羟苯基乳酸为前体通过迷迭香酸合酶（ RAS）催化苯丙烷类代谢途径来源的 4-香豆酸 CoA 和酪氨酸途径来源的 4-羟苯基乳酸缩合、羟化形成迷迭香酸，迷迭香酸再经多步缩合、还原反

12、应合成丹酚酸 B28-29。 1.2.2 丹参酚酸类物质的调控研究 目前 对于 丹 参酚酸类活性成分生物合成的骨架途径 已研究的较为清楚 。丹参酚酸类活性成分生物合成 主体 途径 上的 多数酶基因已被克隆 ，这些 酶 基因的表达及调控与 酚酸类化合物 的累积密切相关。丹参中 苯丙氨酸解氨酶（ PAL）、肉桂酸-4-羟化酶（ C4H） 、 4-香豆素辅酶 A 连接酶（ 4CL） 、 酪氨酸氨基转移酶 （ TAT）、羟苯基丙酮酸还原酶 （ HPPR）以及 迷迭香酸合酶（ RAS）共同参与了酚酸类 化合陕西师范大学硕士学位论文 物主要成分 -丹酚酸 B 的生物合成过程 30。 1.3 各自基因 的介

13、绍 1.3.1 -基因 概述 重点阐述！ 1.3.2 -基因启动子的 研究进展 重点阐述！ 1.3.2 -基因 的 表达调控 重点阐述！ 图 1-2 植物酚酸类物质的合成途径 Figure 1-2synthetic route of plant pheonlic substanve. 第 1 章 引言 5 1.4 本研究的目的意义 缩略词表 英文缩写 英文名称 中文名称 - 第 3 章 丹参 SmPAP1 基因的生物信息学分析 21 第 2 章 丹参 -基因 启动子序列 的克隆 2.1 实验材料、试剂及主要实验仪器 2.1.1 实验所用植物材料 丹参（ Salvia miltiorrhiza

14、Bunge）种子 购自陕西道地药材有限公司，种于 蛭石与营养土 (体积比约为 3： 1)混合的培养土 的 培养盆中于人工气候箱中培养，每隔两天浇一次水。当幼苗长出第二对真叶时栽至含蛭石的营养钵中，每个营养钵 种 3 棵幼苗。人工气候箱培养条件： 光周期 16/8 h（ day/night） ，光照强度 2000 lx，温度 25 2 ， 湿度 60 80 %。本章实验材料为人工气候箱中培养 30 d 后的丹参实生苗。 2.1.2 实验试剂 LA EX Taq Polymerase、 dNTP mix,T4 DNA Ligase,PrimeScript RT reagent Kit Emeral

15、dAmp PCR Master Mix, DL 2000 DNA Marker, pMD19-T Simple Vector（ 购自 TaKaRa公司 ） ； BD Genome Walker Universal Kit（ 购自 Clontech公司 ）； DNA胶回收试剂盒 （ AXYGEN公司 ） ； 氨苄青霉素钠 （ Ampicillin sodium， Amp） Amresco 公司 引物序列 合成 ， 克隆片段测序均 由北京 奥科鼎盛生物科技有限公司 完 成 ； 其它常规试剂采用进口分装或国产分析纯。 附： 实验所用 缓冲液 和 培养基配方 ，及 本章实验中所用到但未列出的各种试剂配

16、制方法参考 分子克隆实验指南 104。 （ 1） 实验所用 抗生素及植物激素的配制： Amp储备液（ 100 mg/mL）：无菌水溶解 10.0 g氨苄青霉素钠 ，定容至 100 mL，0.22 m无菌滤头过滤除菌， 1 mL分装置于 -20 贮存。以 100 g/mL的使用终浓度添加于 LB培养基； （ 2） CTAB提取液 (1L) CTAB 10.0g； PVP 25.0g； 陕西师范大学硕士学位论文 NaCl 40.908g； EDTA 3.7224g； Tris: 6.057g；调 PH8.0。 （ 3） TAE缓冲液（ 50）（使用的时侯稀释至 1）： Tris 242.0 g；

17、EDTA 18.612g； 冰乙酸 57.1 mL； 加 H2O定容 至 1000 mL，室温保存。 （ 4） LB (Luria-Bertani) 培养基 （ 1 L）： NaCl 10.0g； Tryptone 10.0g； Yeast extract 5.0g，调 pH7.0；固体 LB培养基再附加 15.0g琼脂粉。 2.1.3 实验仪器 恒温培养箱 上海 新苗实 验设备有限公司 紫外 -可见分光光度计 UNICAM UV-300 HH-6B 数显恒温水浴锅 国华电器有限公司 摇床 上海 智诚实验设备 有限公司 电泳仪 北京六一仪器厂 DY-8 型 超净工作台 AIR TECH 苏州净

18、化设备有限公司 玻璃仪器气流烘干机 郑州长城科工贸有限公司 涡旋器 姜堰市康健医疗器具有限公司 XH-B PCR 仪 美国 BIO-RAD 公司 NanoDrop 2000 核酸仪 美国 Thermo Scientific 公司 凝胶成像系统 美国 Media Cybernetics 公司 UVP GDS-8000 型 超纯水仪 美国 Millipore 公司 超低温 -80 冰箱 美国 Thermo Fisher Scientific 公司 冷冻台式离心机 德国 Eppendorf 公司 Centrifuge 5802R 微量移液器 德国 Eppendorf 公司 电子天平 德国 Sarto

19、rius 公司 4 /-20 冰箱 德国 SIEMENS 公司 高压灭菌锅 日本 SANY 公司 MLS-3750 型 第 3 章 丹参 SmPAP1 基因的生物信息学分析 23 2.2 实验方法 2.2.1 丹参 基因组 DNA 的提取 丹参基因组 DNA的提取 采用 CTAB法。 （ 1） 将 CTAB在水浴锅中预热至 65，研钵、研磨棒在液氮中预冷。 （ 2） 取 新鲜的丹参 叶片 于研钵中 ， 加入液氮迅速 研磨 使其 成粉末 。 （ 3）称取 0.2 0.3g研磨样于 EP管中，每管中分别加入 CTAB600L,和 L-巯基乙醇12，颠倒混匀数次。 （ 4） 65水浴约 60min，

20、 这一过程中 每 10 min颠倒混匀一次； （ 5）每管加入 4L的 RNA酶， 37水浴约 30min； （ 6） 5,500 rpm离心 15 min，取上清 ； （ 7） 加入氯仿 /异戊醇（ 24:1） 480L， 20L抽提一次 ； （ 8） 12,000 rpm离心 5 min，取上清 ； （ 9）重复步骤 7、 8两次 ； （ 10）加样品二倍体积的无水乙醇， 1/10提及的 NaOAC； （ 11） -20放置 1h以上，用枪头将 DNA挑至 EP管中 ； （ 12）加 750L的无水乙醇和 250L Elution Buffer， 12,000 rpm离心 5 min，洗脱

21、两次，去上清，干燥 ； （ 13）加 0.1 0.5mL Elution Buffer， 65水浴，使 DNA完全溶解。 -基因 启动子 片段的 PCR 扩增 在 NCBI 查到注册号为 GU218694.1 的 -基因，根据其序列特征，利用PrimierPrimier5 软件设计一对引物， ORF 采用 Primer Premier 5.0 软件设计一对特异性的引物 ，引物序列见表 2-1 分别 以 丹参 cDNA 和 gDNA 为模板， 分别 扩增SmPAP1 基因的 ORF 和 DNA 全长 ， 扩增体系（ 50 L）如下： Template DNA 1L Primer F (10 M) 0.5L Primer R (10 M) 0.5L 2 Taq MasterMix 10L dd H2O add to 20L 扩增条件： 94 ， 10 min；