1、第四章 基因工程制药（二）基因工程菌的稳定性；基因工程菌生长代谢的特点；基因工程菌中试（看课本自学）；基因工程菌发酵；基因工程药物的分离纯化；基因工程药物的质量控制。第六节 基因工程菌的稳定性p遗传不稳定性的表现；p遗传不稳定性的的产生机制 ；p影响基因工程菌稳定性的因素；p提高质粒稳定性的方法 ；p质粒稳定性的分析方法 ； 2页，共 97页遗传不稳定性的表现p基因工程菌的稳定性至少应在 25代以上 。p不稳定性两种表现形式：质粒结构不稳定： 重组 DNA 分子某一区域缺失、重排、修饰，表观生物学功能丧失；质粒分裂不稳定： 分裂时出现一定比例不含质粒的子代菌；3页，共 97页遗传不稳定性的的产
2、生机制 p 宿主细胞限制修饰系统 降解 外源重组 DNA 分子；p 宿主细胞中质粒自发缺失重排。p 重组质粒在受体细胞分裂时 不均匀分配。（ 1.质粒的丢失频率。 2.比生长速率的差异）p 比生长速率 ：每小时单位 质量 的 菌体 所增加的菌体量称为菌体比生长速率。它是表征 微生物 生长速率的一个 参数 ，也是 发酵 动力学中的一个重要参数。其大小为 0.693除以倍增时间 td（菌体量倍增）。 4页，共 97页影响基因工程菌稳定性的因素p遗传特性：宿主；载体；外源基因是否整合到宿主染色体上。p发酵工艺： 比生长速率培养基（生长速率、限制性基质）；温度、 pH 值和溶氧； 培养操作方式；5页，
3、共 97页培养基（ 2 1）p培养基的 营养 ：一般，复合培养基营养较丰富，质粒稳定性一般高于合成培养基；但对于酵母，极限培养基比丰富培养基更有利于维持质粒的稳定性；p比生长速率和限制性基质：含有 pBR325的 E.coliGM31和 GY2345：p用葡萄糖培养时，低比生长速率更容易丢失质粒；p用氯化铵培养时，高比生长速率更容易丢失质粒。6页，共 97页培养基（ 2 2）大肠杆菌 HB101菌株中：ppBR322质粒：在磷酸盐限制时最不稳定，其次是葡萄糖和镁离子限制；ppBR325质粒：葡萄糖限制最不稳定，磷酸盐限制稳定。一般， E.coli对葡萄糖和磷酸盐限制易发生质粒不稳定，有些工程菌
4、对氮、钾、硫等表现不稳定。p培养基中添加 酵母提取物和谷氨酸 等有利于提高质粒稳定性。7页，共 97页温度p大多数 基因工程菌，在一定温度范围内，随着温度升高，质粒稳定性下降 ；pE.coli：生长最适温度： 37 ；质粒稳定性最好的温度： 30 ；温敏启动子控制的质粒： 42 诱导外源基因的表达（经常伴随质粒丢失）。8页，共 97页pH值p例如：基因工程酵母表达乙肝表面抗原的质粒：pH为 6.0时，质粒最稳定；pH为 5.0时，质粒最不稳定；9页，共 97页溶解氧和搅拌强度p一般， 低溶氧，质粒稳定性差 （可能是氧限制了能量的供应）；酵母发酵中，需要保持 79 DO，才能维持质粒稳定性。p质粒稳定性随 搅拌强度提高明显下降 。10页，共 97页
