1、 实验八 植物的遗传转化主要方法有： DNA直接导入基因转化1 化学诱导 DNA直接转化2 物理法诱导 DNA直接转化 种质系统介导基因转化1 花粉管通道法介导基因转化2 生殖细胞浸泡法介导基因转化3 胚囊、子房注射法介导基因转化 生物介导的基因转化1 植物病毒介导的基因转化2 农杆菌介导的基因转化优点 : 操作简单，不需要特殊的仪器，获得转基因植株 周期短，转化效率高等农杆菌介导的基因转移1 农杆菌简介革兰氏阴性土壤杆菌。 根癌农杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens):Ti质粒 ,能诱导被侵染的植物细胞形成肿瘤 ,即诱发冠瘿瘤 ; 发根农杆菌 (Agrobacterium
2、rhizogenes):Ri质粒 ,能够诱导被侵染的植物细胞产生毛发状根 。根癌农杆菌 属于根瘤菌科 ,农杆菌属 ,革兰氏阴性菌。好氧，最适生长温度为 25-30 ，最佳生长 pH为 6.0-9.0，研究表明，双子叶植物中有 93属 643种对农杆菌敏感，而单子叶植物则普遍不敏感。2.根癌农杆菌致瘤的机制根癌农杆菌 Ti的致瘤过程需要如下条件： 植物的损伤信号及环境因子。 菌体的识别和附着位点。 Ti质粒的必需组成元件，包括 T DNA区域和 致毒基因 (Vir gene)。 位于根癌农杆菌染色体上的一些其他遗传座位 植物损伤信号及环境因子 植物损伤信号 （糖类和酚类化合物）可指导农杆菌对植物
3、细胞的趋化性移动，并可诱导农杆菌 Vir基因的表达。化学诱导信号 中最强的为酚类化合物，包括儿茶酚、没食子酸、香草醛，乙酰丁香酮等 , 以 乙酰丁香酮 的诱导效果最佳。 。菌体识别和附着位点 在植物细胞壁上存在着由碳水化合物、蛋白质和果胶组成的农杆菌附着的受体位点，位于完整细胞的表面。在农杆菌细胞壁上也存在着吸附到植物细胞壁的结合位点，由位于细菌外膜的蛋白质和脂多糖构成。农杆菌附着到植物细胞上后，分泌出果胶酶等物质，消化植物细胞壁，从而形成农杆菌侵入植物细胞的通道。 T-DNA区： 转移 DNA，农杆菌侵染细胞时，从 Ti质 粒上切割下来转移到植物细胞上的一段 DNA Vir区： 毒性区，激活
4、 T-DNA转移。 Con区： 接合转移编码区，该区存在着与细菌间接合转移的有关基因（ tra），调控 Ti质粒在农杆菌之间的转移。 Ori区： 复制起始区 染色体上的一些其他遗传座位这些基因在致瘤过程中具有决定农杆菌细胞表面特性和调控 Ti质粒Vir基因的表达的作用。Ti质粒的必需组成元件土壤农杆菌介导转化主要步骤： (1)细菌在植物敏感细胞上吸附； (2 )农杆菌中 Ti质粒上的 Vir区基因被激活 ；损伤细胞分泌物 Vir自身磷酸化 VirG(转录因子 ) (3)T-DNA切割和 T-DNA复合物形成；virD基因产物对 T-DNA进行剪切virE2蛋白分子（为 DNA单链结合蛋白）相结
5、合，形成 T链复合物（ T-complex）。 (4)T-DNA复合物由农杆菌进入植物细胞；T链复合物在 virD2和 virE2核定位信号（ NLS）引导下以virD2为先导被转运入细胞核 (5)T-DNA整合到植物染色体上并且进行表达。1. 农杆菌的培养培养基： LB, YEM, YEB 生长周期 : 固体培养 1-2天，液体培养 2-3天。农杆菌接种后，一般需要在 25-30 的条件下， 1-2小时才开始分裂。因此当用抗生素筛选菌株时，需要在液体培养液中 2小时后再加入抗生素，以便让抗性基因充分表达。2 Vir区基因活化诱导物的使用乙酰丁香酮 (AS) ，羟 基乙酰丁香酮 (OH-AS)使用方法： 1, 在农杆菌培养液中加入 AS。2, 共培养基中加入。3，在农杆菌培养液中和共培养基都加入 AS。使用的 pH值： 5.0-5.6, Vir区基因的诱导达到最高水平。3外植体的选择转化只发生在细胞分裂的一个较短的时期 细胞分裂周期的的 S期（ DNA合成期） 合子胚、体细胞胚或者胚性细胞。 性质未定细胞： 分生组织， 微管形成层，静止薄壁组织及胚，雌、雄配子体，这些组织的细胞具有很强的分生能力，而且发育性质未定，当这些组织发生创伤或者环境因素诱导时，则加速分裂，形成愈伤组织或者迅速分化，趋向某一器官的发育、处于转化的敏感期。
