银杏叶乳膏研制及皮肤抗衰老作用初步研究.doc

1、银杏叶乳膏研制及皮肤抗衰老作用初步研究摘 要：目的：研制银杏叶乳膏及其对小鼠皮肤抗衰老的作用。方法：用纳米级银杏叶提取物粉末制备银杏叶乳膏。采用实验兔正常皮肤组和破损皮肤组给药，进行皮肤刺激性强度评价和组织病理检查。注射 D-半乳糖建立小鼠衰老模型，将小鼠背部涂抹银杏叶乳膏、维生素 E 乳膏、空白基质乳膏，测定小鼠背部皮肤组织匀浆中丙二醛（MDA） 、超氧化物歧化酶（SOD） 、羟脯氨酸（HYP）含量，并取皮肤组织作组织病理学检查。对小鼠皮肤组织提取 RNA，采用定量 PCR 方法，检测 SOD 基因的转录。 结果：制备银杏叶乳膏，质量符合要求；加速/长期条件下稳定。在实验兔皮肤刺激性试验中，

2、皮肤无红斑、水肿等刺激性反应；在皮肤抗衰老试验中，与模型对照组比较，银杏叶乳膏各组 MDA含量降低，SOD 基因表达水平显著提高，SOD 活力升高，HYP 含量升高，中、高剂量组各指标变化均显著（P0.05，P0.01） ；同时，组织病理学结果显示中、高剂量组小鼠皮肤结构清晰完整，真皮层增厚，基底细胞增多，胶原纤维数目增多，毛囊数目增多。 关键词：银杏叶提取物 乳膏 超氧化物歧化酶（SOD） 羟脯氨酸（HYP） 丙二醛（MDA） 抗衰老 1 乳膏抗衰老实验 1.1 动物实验 1.1.1 衰老模型的建立2-8 取 3 月龄 KM 小鼠 70 只，小鼠颈背部皮下注射 1000mg/kg D-半乳糖

3、，1 次/天，连续注射 42 天。另取 10 只小鼠作为正常对照组，皮下注射等体积 0.9%氯化钠注射液。所有小鼠背部脱毛，暴露约 2cm2cm 大小皮肤。1.1.2 分组及给药 将上述衰老模型小鼠随机分成 6 组，每组 10 只。空白对照组涂抹0.5g 不含银杏叶提取物的空白基质，低、中、高剂量组分别涂抹含银杏叶提取物 1%、2%、4%浓度的乳膏 0.5g，维生素 E 组涂抹 0.5g 维生素 E乳膏。每日早晚各一次，开始造模当日起连续涂抹 42 天，涂抹前先用温水洗净皮肤，并及时剃去新长出的鼠毛。口服给药组灌胃给予 100mg/kg的银杏叶提取物，每日早晚各一次，开始造模当日起连续给药 4

4、2 天。 1.1.3 实验标本与取材方法 42 天后，所有小鼠颈椎脱臼处死，去毛，取背部正中皮肤0.5cm0.5cm 大小，迅速放入 10%中性福尔马林液中固定，作组织病理学检查。取余下背部皮肤用于制备 10%皮肤匀浆液。 1.1.4 10%皮肤匀浆液的制备 剪取背部皮肤组织 0.5g，用预冷生理盐水漂洗，除去皮下脂肪和其他结缔组织，滤纸拭干，称重，剪碎组织块后倒入匀浆管中，加入该组织块 9 倍质量的生理盐水，用组织分散机制成质量分数为 10%的组织匀浆。取少量组织匀浆涂片，在显微镜下观察细胞破碎情况，若破碎不完全，则反复冻溶 3 次，使其完全破碎，细胞内容物完全游离在液相中。 1.2 SOD

5、、MDA 及 HYP 的检测 1.2.1 组织切片染色方法 取已固定皮肤组织，石蜡包埋、切片、脱蜡、脱水、HE 染色，光学显微镜（200）下观察。 1.2.2 皮肤生化指标的测定 皮肤组织匀浆 SOD 活力、MDA 含量的分别参照南京建成生物工程公司SOD 及 MDA 试剂盒说明书方法测定。 1.2.3 皮肤组织 HYP 含量的测定 参照南京建成生物工程公司 HYP 试剂盒说明书方法测定皮肤组织匀浆中 HYP 含量。 1.2.4 统计学处理 所有实验结果以 xs 表示，采用组间 t 检验统计学方法分析。 1.3 皮肤 SOD 基因表达检测方法9-10 1.3.1 皮肤组织总 RNA 的提取：

6、总 RNA 的提取采用改进的异硫氰酸胍酚氯仿 RNA 快速提取法11-12 。 1.3.2 反转录： 1.3.3 实时定量 PCR 分析： 2 结果与讨论 2.1 抗衰老实验检测 2.1.1 动物外观及行为学观察 连续造模 42 天后，模型对照组小鼠出现脊椎隆起，体形消瘦，毛色灰暗稀疏、无光泽，行动迟缓，与正常组相比，出现明显的老年体征，证明衰老模型成功建立。银杏叶乳膏中、高剂量组及维生素 E 组的衰老模型小鼠皮毛浓密光亮、顺滑、行动敏捷；空白基质组及低剂量组小鼠则无明显改善。 2.1.2 皮肤组织病理学形态观察 正常对照组（图 3-1） ，皮肤组织结构正常，基底细胞排列整齐，真皮层厚度正常，

7、细胞层数均匀，胶原纤维丰富，排列致密，毛囊数目正常，排列均匀。模型对照组（图 3-2） 、空白对照组（图 3-3）皮肤结构紊乱，真皮厚度变薄，皮下组织稀疏，基底细胞层数减少，体积减小，胶原纤维排列疏松，厚度变薄，毛囊数目减少。维生素 E 组（图 3-7） 、口服给药组（图 3-8） ，皮肤结构较清晰，真皮层较模型对照组增厚，基底细胞增多，胶原纤维数目较，排列较致密，毛囊数目较模型对照组增多。中、高剂量组（图 3-5、3-6） ，皮肤结构清晰完整，与模型对照组相比，真皮层明显增厚，基底细胞增多，胶原纤维数目增多，排列致密，毛囊数目增多。低剂量组（图 3-4）上述改善不明显，与模型对照组镜下所见无

8、明显不同。 2.1.3 小鼠皮肤生化指标检测 结果见表 4、图 4图 6，与正常对照组比较，模型对照组小鼠皮肤中丙二醛含量明显升高（P0.05） 。 2.1.4 SOD 基因表达 以小鼠基因 GAPDH 作为内参，用实时定量 PCR 方法检测各组小鼠皮肤组织铜锌 SOD 基因 mRNA 变化. 表 5 显示，D-半乳糖造模小鼠 SOD 基因表达下调，口服维生素 E 阳性对照组，口服银杏提取物组，银杏乳膏涂抹组 SOD 基因均有表达升高，其中银杏乳膏组中，高剂量组基因表达相对上调具有显著性差异，特别是高剂量组 SOD 基因表达上调极显著， 结果见表 5。 2.2 讨论 制备的银杏叶提取物乳膏质量

9、稳定，制备过程中，应注意 EGb 加入后溶解完全，防止提取物聚集形成含量不均匀。 D-半乳糖致小鼠氧化损伤的主要机制之一是引起机体组织内抗氧化酶的活力降低，从而也导致了过氧化脂质的升高。小鼠抗衰老实验中采用小鼠注射 D-L 半乳糖致小鼠衰老证明实验小鼠衰老机制正常，符合实验条件，本实验研究表明，D-半乳糖诱发小鼠酶活力下降，同时 SOD 基因表达（mRNA 转录）也出现明显下调。提示 SOD 酶活力下降可能的主要原因可能是由于 D-半乳糖进入机体组织后，首先是抑制了 SOD 基因的表达，进而使 SOD mRNA 转录水平降低，SOD 蛋白合成减少，导致了 SOD 酶活力的降低。 实验研究结果表

10、明，中、高剂量的银杏叶乳膏能明显增加衰老皮肤中羟脯氨酸含量，使衰老皮肤胶原蛋白的合成增加，进而促进胶原纤维形成，使皮肤真皮层厚度增加，从而缓解皮肤衰老。皮肤组织病理学形态观察也验证了这一结果。同时，银杏叶乳膏通过增强 SOD 基因表达，提高 SOD 活力，降低 MDA 含量，从而清除体内存在自由基，降低过氧化脂质形成速度，减少氧化应激，延缓皮肤衰老。高剂量的银杏叶乳膏抗皮肤衰老的效果明显优于维生素 E 乳膏。 而在小鼠局部给予银杏叶提取物（EGB）乳膏后，小鼠皮肤中的 SOD基因表达上调，SOD、HYP 有明显的升高，SOD 酶活力上升，证明了银杏叶提取物（EGB）乳膏的抗衰老效果。通过与维

11、E 组、口服银杏叶提取物（EGB）粉末组的 SOD、HYP、MDA 等参数的对比，说明银杏叶提取物乳膏的抗衰老效果优于目前临床上使用的维 E 乳膏。局部效疗优于口服组，且能降低口服带来的不良反应。说明 EGb 乳膏涂于皮肤表面，有很好的吸收，清除过多的氧自由基，增加皮肤胶原蛋白的合成能力，抑制衰老。乳膏使用气味及外观等有待改善。乳膏中活性成份的作用机理及透皮机制有待研究。抗衰老试验中对银杏叶活性成份透皮吸收后，血药浓度变化情况，及组织器官的分布情况，有待进一步研究。本品的临床疗效有待进一步研究。 参考文献 1化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究指导原则M. 国家食品药品监督管理局药品审评中心，2007. 2郭长青，郭妍，等.银杏叶提取物 EGB761 对 D-乳糖诱导的心肌细胞老化的保护作用J.中国临床药理学与治疗学，2010，15（4）：376-380. 3 董晓华，张丹参，武海霞.衰老动物模型的研究进展及评价.河北北方学院学报，2004，21 （6） ，41-44. 4 王红丽，吴铁，等.D-半乳糖致衰老模型小鼠皮肤衰老的观察J.中华老年医学杂志，2004，23（8）：566-568. 5刘克明，王春花，张明月等.D-半乳糖致氧化损伤小鼠 SOD 酶活力与 SOD 基因表达的相关性