1、第七章 免疫电镜一 电镜免疫组织化学技术概述二 几种常用的透射电镜方法要点一 电镜免疫组织化学技术概述特异性抗体用电子致密物质，如铁蛋白、胶体金等标记后，使之与组织超薄切片中的抗原结合，在电镜下观察到标记物所在位置，即为抗原抗体反应的部位。 v （一）组织固定与取材v （二）免疫染色v （三）包埋 v （四）对照试验（一）组织固定与取材v 原则：既要保存良好的细胞超微结构，又要注意保持组织的抗原性。v 固定：固定剂的要求： 不损害细胞内抗原的活性； 固定速度快、效果好； 分子量小，易于渗透； 固定后 ,不引起交联，造成空间的阻碍，影响标记抗体进入抗原位。影响固定的因素有： 固定剂的种类； 固定
2、剂的浓度，浓度过大，对抗原的活性有影响，浓度过小，固定效果差； 固定剂的 pH； 固定剂的温度 ,一般采用 2 4 冷固定；这样能降低细胞自溶作用和水分抽提； 固定时间与温度有关，温度高，固定快，也与缓冲系的离子强度有关，离子强度大，渗透压大，穿透力强，固定要快。不同的固定剂，或同一固定剂的不同浓度所需的固定时间也不一致； 与被固定的细胞类型有关。 选用固定剂不宜过强。常采用灌注固定法。多聚甲醛 戊二醛混合液过碘酸 赖氨酸一多聚甲醛液 (PLP液 )：对含糖类丰富的组织固定效果特佳。（使用前必须用已知效价的抗原做一系列预实验。如固定剂的种类浓度、温度、 pH及固定时间等。然后做出预处理的效价，
3、作为失活参考以再选择最适条件。）v取材： 免疫电镜技术较光镜免疫化学技术要求更迅速、精细。灌流后需续固定：四氧化锇（二）免疫染色v 包埋前染色 v 包埋后染色 v 超薄切片免疫染色 1 包埋前染色即先行免疫染色，在解剖显微镜下将免疫反应阳性部位取出，修块；常规电镜方法处理，经锇酸固定、脱水、树脂包埋。特异性免疫反应的范围太小，可作二次包埋：即第一次包埋时将组织置于两层塑料片之间，中夹环氧树脂如夹心面包式，进行高温聚合，然后在解剖显微镜下取出需要部位作第二次包埋。包埋前染色的组织，以中层较为理想。表层因受机械修整，结构保存不好，深层因抗体不能透入，免疫反应弱或无。半薄切片可在相差显微镜下不染色观察（ PAP），免疫反应部位呈黑点状；HE或甲苯胺蓝染色的半薄切片上，免疫反应部位呈棕黄色。取相连续的超薄切片为避免电镜铅、铀染色反应与免疫反应之间的混淆，分别以两个铜网捞取，其中之一进行染色观察，另一以铀单染色或不染色进行对照观察。v 包埋前染色法的优点是： 切片染色前不经固定、脱水及包埋等过程，不破坏抗原。 在免疫反应阳性部位定位作超薄切片，提高电镜下的检出率。适用含抗原量较少的组织。
