1、动物科技学院硕士研究生毕业论文答辩,布鲁氏菌019株弱化与基因缺失株构建及初步免疫评价,姓 名：指导老师：,研究背景,研究目的,试验研究,全文结论,1,2,3,4,汇报内容,论文创新,5,文章发表,6,一、研究背景,布鲁氏菌病 (Brucellosis) 是一种人畜共患传染病，在全世界范围内广泛分布，在我国也有大量的动物发生感染，新疆是我国的高发地区。 动物感染布鲁氏菌后主要表现为波浪热，关节肿大及生殖系统的疾病。,目前布鲁氏菌病的预防控制主要通过疫苗接种，我国主要采用弱毒活疫苗有M5-90、S2等。 疫苗株的缺陷：毒力仍然较强；存在返强的潜在威胁；不能有效区分疫苗免疫和自然感染。,一、研究背
2、景,pgm基因编码的磷酸葡萄糖变位酶，参与布鲁氏菌脂多糖O链装配过程，该基因的缺失会影响光滑型布鲁氏菌LPS的合成。 由于LPS是介导宿主先天性免疫反应的重要抗原，pgm基因是布鲁氏菌重要的毒力基因。,一、研究背景,目前，国内外已有布鲁氏菌pgm基因突变或缺失的报道： Juan等将布鲁氏菌S19进行了pgm基因敲除，获得了布鲁氏菌pgm基因缺失株，动物试验结果表明：pgm基因缺失株不能合成LPS，同时也检测不到O链抗体，和亲本株S19有相似的免疫保护性。,一、研究背景,布鲁氏菌019株是1980年在新疆紫泥泉种羊场被发现并分离；较其他野毒株，毒力较弱，但依然可诱发动物的病理损伤，主要引起公羊的
3、附睾炎等症状。 布鲁氏菌氢氧化铝佐剂灭活苗接种羊群后，保护率可达75%。,一、研究背景,通过物理和化学的方法对布鲁氏菌019株进行诱导突变，分析生长状况及毒力的变化。 针对布鲁氏菌磷酸葡萄糖变位酶基因（pgm）定向构建布鲁氏菌019的pgm基因缺失株，并对其毒力及免疫效果进行评价；探讨布鲁氏菌019株致弱后作为疫苗株的潜力。,二、研究目的,三、实验研究,布鲁氏菌019株弱化与毒力评价,实验二,布鲁氏菌019pgm基因缺失株构建,实验三,布鲁氏菌019pgm毒力及初步免疫评价,实验一 布鲁氏菌019株弱化与毒力评价,0.1%、0.05%吖啶橙,实验方案,连续转接50次,0.1%、0.05%苯酚,
4、紫外线照射5min、2min,生长曲线,小鼠脾脏指数,脾脏CFU计数,评价毒力变化,布鲁氏菌019株,自身生长能力,疫苗应用前景评价,结果与分析,1、生长曲线的绘制,结果显示：25 h后进入对数生长期，细菌随时间变化快速增长，61 h后菌数趋于稳定。,2、代时比较,结果显示：各处理组细菌代时与亲本019株相比较均有不同程度的增加。,结果与分析,3、小鼠脾脏指数变化,结果显示：1108菌/只腹腔接种小鼠后，苯酚处理组和紫外照射处理组小鼠脾指数明显低于亲本株019株（P0.05）。,结果与分析,4 、小鼠脾脏细菌计数,结果显示： 各处理组布鲁氏菌在小鼠脾脏内的细菌均有不同程度的减少，但均显著高于疫
5、苗株M5-90组。经0.1g/L吖啶橙处理和5min紫外线处理组小鼠脾脏CFU与亲本株019相比明显减少，差异显著（P0.05），但显著性高于布鲁氏菌M5-90和S2组（P0.05），显著性高于布鲁氏菌M5-90和S2组（P0.05），随之时间的延长，抗体水平呈现先增加后平稳趋势，但是，均显著性低于疫苗株M5-90（P0.05），但均低于疫苗株M5-90（P0.05）；在第30天，019pgm活全菌佐剂制剂诱导产生的IFN-含量最低，显著低于其他实验组。,讨论,1、 感染小鼠后毒力评价 019pgm相较与亲本019株感染小鼠实验结果显示， 019pgm毒力没有发生明显下降，可能是由于pgm基因
6、并非布鲁氏菌的主效毒力因子，或该基因在布鲁氏菌内还有其他功能相近的基因共同发挥作用。,讨论,2、体液免疫水平分析 019pgm组与亲本株019组小鼠在感染初期第10天即可产生较高水平的 IgG，并在第20天后达到最高水平。 同时本研究中使用的完全弗氏佐剂，可以使抗原在体内缓慢释放，延长与免疫细胞作用时间，并可有效诱导机体产生高滴度的抗体。,讨论,3、细胞免疫水平分析 IFN-是强有力的巨噬细胞活化因子，对于杀死胞内的布鲁氏菌发挥巨大的作用。 细胞因子IFN-检测结果表明，M5-90在诱导机体产生IFN-的能力强于019pgm和019全菌佐剂制剂，说明灭活疫苗在诱导细胞免疫方面仍然存在不足。,讨
7、论,1. 经紫外照射5min处理可有效降低布鲁氏菌019毒力。2. 构建并筛选了019pgm缺失株，10代内未发生回复突变；其毒力与亲本株无明显差异。3. 制备布鲁氏菌019pgm灭活全菌佐剂制剂，初步免疫评价结果显示：其可诱导产生一定水平的体液免疫和细胞免疫水平，但均低于M5-90弱毒苗。,四. 全文结论,本实验构建了布鲁氏菌019株pgm基因缺失株，并检测了其毒力；并对其免疫效果进行了初步评价。,五. 论文创新,六. 文章发表,文章发表,六. 文章发表情况,李亚, 陈创夫, 张辉, 等. 流产布鲁氏菌2308株磷酸甘露糖变位酶pmm基因缺失株构建及鉴定.西北农业学报. 刊用.,致谢,值此毕业之际，向尊敬的陈创夫教授致敬，感谢尊师3年来对我的培养。 感谢张辉老师、郭飞老师、王远志老师对课题研究的指导。 感谢王震博士、李天森博士、李志强博士、张俊波博士及人畜共患病实验室全体同学给我的帮助。 感谢动物科技学院对我的培养。感谢我的父母、家人和朋友，谢谢他们无私的支持和帮助！,谢谢各位评委老师,
