艾滋病抗体检测技术免疫印迹法及质量控制黎俊宏.ppt

1、艾滋病抗体检测技术（免疫印迹法）及质量控制,黎俊宏检测检验中心艾滋病确证实验室,常州市疾病预防控制中心,Changzhou Center for Disease Control and Prevention,全国艾滋病检测技术规范（2015年修订版）第六章 艾滋病病毒感染实验室检测策略,我国自上世纪80年代发现第一例艾滋病病例至今，各地市艾滋病感染者呈逐年增长趋势。 4 临床诊断相关的检测策略及结果报告 4.1 使用抗体检测试剂的检测流程：,4.3 补充试验检测策略补充试验分为抗体确证试验和HIV-1核酸试验。抗体确证试验包括免疫印迹试剂（WB）和条带/线性免疫试验（RIBA/LIA）， 特定

2、条件下的替代检测（三种酶联免疫试验、三种快速试验或者酶联免疫加快速试验），免疫层析或免疫渗滤试验。HIV-1核酸试验包括定性和定量试验。,*两种试剂可以是原有试剂加另一种试剂， 也可以是两种不同试剂。,全国艾滋病检测技术规范（2015年修订版）第六章 艾滋病病毒感染实验室检测策略,全国艾滋病检测技术规范（2015年修订版）第六章 艾滋病病毒感染实验室检测策略,HIV确证试验的方法,2,3,1,4,LIA 条带免疫试验,RIPA 放射免疫沉淀试验,IFA 免疫荧光试验,WB 免疫印迹试验,HIV抗体WB试验具有很高的敏感性和特异性，是国内HIV抗体确证的金标准。,RIBA/LIA 条线/线性免疫

3、试验,Western Blot与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳 ，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如NC膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。,WB的原理,WB检测HIV抗体的原理,硝酸纤维试剂膜条上结合了天然灭活的HIV-1型病毒蛋白的分离

4、颗粒和特异性的HIV-2型合成多肽。在膜条分别加入稀释的血清或血浆样本或对照，孵育。如果样本中含有HIV-1和HIV-2型的特异性抗体，则抗体会与试剂膜条上的HIV-1蛋白和HIV-2多肽结合，通过清洗去除试剂膜条上的未结合物，与HIV蛋白特异性结合的抗体再通过与带有碱性磷酸酶的羊抗人IgG抗体结合，加入BCIP/NBT底物等一系列反应即可显色。,全病毒裂解液电泳得到的膜条,在HIV颗粒中，外膜蛋白（env）基因编码的一个蛋白经糖基化后形成包膜蛋白前体（gp160），其在蛋白酶作用下裂解成外膜蛋白（gp120）和跨膜蛋白（gp41）；核心蛋白（gag）基因编码的前体蛋白（p55）被蛋白酶裂解为

5、衣壳蛋白（p24）和内膜蛋白（p17），p39为p55的碎片；逆转录酶蛋白（pol）基因编码的逆转录酶（p66、p51）和核酸内切酶（p31），而机体对上述HIV蛋白产生相应的抗体，又在WB中出现相应的不同组合的带型。 这既是确证HIV抗体阳性的条件，又能作为HIV感染期和AIDS期的参考依据。,HIV模型图,脂双层膜,gp120,gp41,包膜糖蛋白,p24衣壳蛋白,p17内膜蛋白,p7核衣壳蛋白,逆转录酶,蛋白酶,整合酶,env编码 外膜蛋白gp120 跨膜蛋白gp41（包膜蛋白前体gp160为gp41聚合体）,env基因的结构及env蛋白,gag基因的结构及gag蛋白功能,gag基因编码

6、病毒核心蛋白 前体蛋白p55（p39为p55的碎片）、衣壳蛋白p24、内膜蛋白p17,pol基因的结构及pol蛋白,pol基因编码的酶类p66和p51蛋白为逆转录酶p32蛋白则为整合酶P11蛋白为蛋白酶,严格遵守实验室标准操作程序(SOP),确证试验的要点,严格按照试剂盒说明书操作,严格控制防止样品间的交叉污染,试剂,MP生物医学亚太私人有限公司（MP）HIV-1/2混合型试剂（MP HIV BLOT 2.2）上海英旻泰生物技术有限公司（IMT）HIV-1/2混合型试剂（IMT HIV-1/2 Blot）,实验蓝图,实验原始记录,结果的判定,首先要确定可见到标本质控带.如果标本质控带是阴性,则

7、检测无效;因为这表示技术上有错误,如未加样本,酶结合物或底物液。与强和/或弱阳性对照试剂膜对照,确定检测试剂膜上每一条带的分子量。按照试剂盒说明书判定标准，判断待测样品为阳性、阴性或不确定。,HIV-1抗体阳性 检测出2条env带（gp160/gp41和gp120）及gag（p17，p24，p55）或pol（p31，p51，p66）HIV抗体阴性 没有病毒的特异性条带或只检测出p17抗体HIV抗体不确定 出现任何病毒特异条带，但不足以判断为阳性,试剂盒说明书,技术规范（2009版）,HIV-1抗体阳性 至少有2条env带（gp41和gp160/gp120）出现，或至少1条env带和p24带同时

8、出现。HIV抗体阴性 无HIV抗体特异带出现。HIV抗体不确定 出现HIV抗体特异带，但不足以判定阳性。HIV-2抗体血清学阳性出现HIV-2型特异性指示带的样品：如果同时呈HIV-1 抗体阳性反应，只需报告HIV-1 抗体阳性，不推荐进一步做HIV-2 抗体确证试验；如果同时呈HIV-1抗体不确定或阴性反应，需用HIV-2型确证试剂再做HIV-2的抗体确证试验。同时符合以下二条标准，即出现至少2条env 带（gp36和gp140/ gp105），和试剂盒提供的阳性判定标准，可判为HIV-2抗体阳性。,HIV基因组,ENV区 gp160:gp41的聚合体 宽的扩散糖蛋白带 gp120:外膜蛋白

9、 扩散糖蛋白带 gp41:跨膜蛋白 扩散糖蛋白带POL区 p66:逆转录酶 细窄条带 p51:逆转录酶 细窄条带 p31:核酸内切酶 双重条带GAG区 p55:前体蛋白 细窄条带 p39:p55的碎片 细窄条带 p24:核心蛋白 宽阔条带 p17:核心蛋白 宽阔条带,条带,确证阳性,首次确证不确定,孕妇第一次确证,MSM第一次确证,再次确证阴性,孕妇4周后随访确证结果,MSM4周后随访确证结果,From不确定to阳性,送检时间：2011年1月送检时间：2011年2月,质量控制,第二章 HIV抗体检测,7 质量控制 7.1 酶免或发光法抗体检测的室内质量控制7.2 快速法抗体检测质控,WB法HI

10、V抗体确证实验质控,7.1 酶免或发光法抗体检测的室内质量控制7.1.1 试剂盒内部对照7.1.2 室内质控品7.1.3 Levey-Jennings质控图7.1.4 室内质控其他方式“即刻法”质控,试剂盒内提供的阳性和阴性对照：判断每次实验的有效性，不能作为室内质控品使用；每次须有，且只能同批号试剂盒用；如无效，须重做。,非试剂盒组份的外部质控品：监控检测的重复性，且须为弱阳性；判断该批临床样品检测的可信性；每次须有；失控须重做。可买或自制：稳定、无菌、不含影响试剂反应的防腐剂。,第二章 HIV抗体检测,7.1.3 Levey-Jennings质控图,7.1.3.1 质控图参数 外部质控品的

11、均值和标准差应建立在实验室常规使用方法对外部质控品重复测定的基础上。一般采用在不同批次检测取得至少20个数据；如果仅做少量批次的检测，也至少做5个批次的检测，每个批次中不少于4个质控血清测定结果，以建立一个临时性的均值和标准差，当达到20批次数据后，替代临时性的均值和标准差。 （1）算术平均值（ ）：代表一组质控品测定S/CO值的均值。为了统计学上有显著性意义，应该采用至少20次（天）测得的外部对照质控品的S/CO值计算平均值。 （2）标准差（s）：是描述样品与均数之间离散程度的一个指标，是与质控品S/CO值均值有关的预期范围。一组S/CO值的标准差以s表示。 （3）变异系数（cv）：是反映各

12、次S/CO值相对于均值离散程度的一个指标，可以用来衡量检测的重复性或精密度。 （4）控制限：由实验室根据对外部质控品检测结果的均值和标准差来确定。例如，按照12S质控规则，控制限为外部质控品S/CO均值加减2个标准差；按照13S质控规则，控制限为外部质控品S/CO均值加减3个标准差。,7.1.3 Levey-Jennings质控图,7.1.3.2 质控规则 实验室在报告结果之前必须评价质控数据，可通过图形记录的检查或由计算机审核结果来决定。目前有许多质控规则，常用的是12S和13S规则。（1）告警（12S）：当外部质控品的S/CO值超出 +2s范围时，系统处于告警状态，应予注意，是否可以继续检

13、测需要进一步观察。若将12S做失控标准，有较高的假失控概率，所以一般不采用。（2）失控（13S）：当外部质控品的S/CO值超出 +3s范围时，系统处于失控状态，本次实验结果不能被接受，可能是系统误差、随机误差或外部质控品 稳定性下降所致。7.1.3.3 质控图的分析及失控处理 实验室应建立质控图分析及失控情况处理的程序。当出现失控时，必须找出发生问题的原因，找出解除问题的方法，并消除原因。,外部质控品？实验操作？不同人员？仪器？（如加样枪？洗板机堵孔？酶标仪未每年校准？）绘制质控图错误？,7.1.4 室内质控其他方式“即刻法”质控,7.1.4 室内质控其他方式“即刻法”质控,（1）当SI上限和

14、SI下限 n3s值时说明该值已在3s范围之外，属“失控”。“即刻法”只能在前20次内使用，超出即可采用L-J质控图方法。,第二章 HIV抗体检测,7.2 快速法抗体检测质控7.2.1 试剂内对照7.2.2 室内质控品对照7.2.3 开展抗体相关检测的实验室须参加有资质机构组织的能力验证，或室间比对。,质控窗口内的质控带，试剂自带内部过程质控：实验操作全部完成且实验所用材料处于工作状态；清洁的检测区背景是内部阴性过程质控；如未有红色质控带：试剂盒内质控无效，该结果无效，须重做。,外部质控品可商用或自制质控品：抗体阳性和阴性样品；下列情况需做质控：更换试剂批号、检测人员、包装、试剂厂家。除此之外，

15、建议每个检测日检测一次阳性和阴性质控品；如果日检测量大于50份样品，至少应作2次质控。,出现以下问题，提示存在质量隐患，应引起重视：运输包装、内盒或试剂盒的物理损伤；在单包装内存在混杂物质；标签出现错误、缺失或字迹模糊 （特别是产品名称或出产厂家名称，批号和货号，失效期或/和生产日期）；缺失目录；泄漏或污染；不适宜的存放条件；保护包装纸破损或污染；未达到质量控制标准 （阳性/阴性控制结果以及质控条带出现与否等标志）；试剂质量问题须报告省确证中心实验室。,WB法HIV抗体确证实验质控,一、室内质控: 仪器质控：仪器是否运转正常，管路是否堵塞； 过程质控： 1、试剂质控，强阳、弱阳、阴性对照； 2

16、、样品质控，有无交叉污染，相邻的槽道是否出现完全一样的条带； 3、数据质控，室温253（ 20 需开空调），结果判读需两名判读人和一名审核人。二、外部质控：参加有资质机构组织的能力验证，即室间比对，如全国艾滋病检测实验室HIV抗体血清学能力验证。,条带位置,试剂批号不同甚至同一批号不同盒子，同一条带的位置并不是相同的,早期感染带型？（疑似）,Gp160+p24 gp120很弱或者没有或还有其他,早期感染带型？（疑似）,早期感染带型？（疑似）,进展带型？,AIDS（晚）期带型？,ENV带强度保持恒定，p24缺失或强度明显降低,AIDS（晚）期带型？,第二章 HIV抗体检测6.2 确证报告6.2.

17、1 WB及 RIBA/LIA报告,急性期,无症状期,窗口期,HIV抗原、抗体变化图,Anti-P24,Anti-gp41/120(anti-gp36),HIV RNA,Anti-Ag,1周 2周.1月 2月.1年 2年 3年.10年.,艾滋病期,Anti-Ab,献血员中一例阳性,送检时间：2010年12月,备注：9.13献血，酶免阴性，核酸阳性。12.18检测，酶免阳性，核酸阳性。建议仔细询问发生高危行为的时间。,工欲善其事必先利其器,加样器的使用,准备,设定移液量,安装吸头,按压至第一停点位置,吸液,贴壁,轻轻按压放液,贴壁,按压至第一停点后，再按压第二停点，排尽吸头残余液体,松开按钮，弹回

18、至原来的位置,按压吸头推顶，退除吸头,加样器的使用,正向加样法,反向加样法,加样器-注意事项,根据所需取液量选择相应的移液器及吸头，使用带滤芯的吸头，可防止交叉污染。,日本WATSON ：低吸附、高精度、无RNA酶、无DNA酶、无热源、加长吸头 、带滤芯已消毒,吸取液体时应缓慢匀速吸取，避免液体溅到移液器头上；打出液体后拇指不应松开按钮，将吸液嘴压掉后再将拇指松开，避免液体回吸。在调整取液量的旋钮时，不要用力过猛，并应注意计数器显示的数值不要超过其可调范围。连续可调式移液器不可在无吸头时使用，吸头有液体时不可平放或倒置。,加样器-注意事项,操作时要慢和稳，吸嘴浸入液体深度要合适，吸液过程尽量保

19、持不变；改吸不同液体、样品或试剂前要换新吸嘴；发现吸嘴内有残液时必须更换；新吸嘴使用前应先预测。为防止液体进入移液器套筒内，注意以下几点：压放按钮时保持平稳；移液器不得倒转；吸嘴中有液体时不可将移液器平放；5ML及10ML移液器一定要加滤芯。切勿用油脂等润滑活塞或密封圈。使用了酸性或有腐蚀蒸气的溶液后，最好拆下套筒，用蒸馏水清洗活塞及密封圈。,加样器-注意事项,连续可调式移液器在取样加样过程中应注意移液嘴不能触及其他物品，以免被污染；移液嘴盒（架子）、废液瓶、所取试剂及加样的样品管应摆放合理，以方便操作过程、避免污染为原则。连续可调式移液器在使用完毕后应置于移液器架上，远离潮湿及腐蚀性物质。在

20、取液之前，所取液体应在室温（15-25C）平衡；液体温度与室温有异时，将吸嘴预洗多次再用；移液温度不得超过70。,加样器-注意事项,加样器-常规维护,加样器应根据使用频率进行维护，但至少应每3个月进行一次，具体方法如下：1一般维护可用中性洗涤剂（如洗餐具用的洗涤灵）清洁，或者用60%的异丙醇，然后用蒸馏水反复洗涤，去除洗涤剂或异丙醇，晾干。清洁后活塞处可使用一定量的润滑剂。2如果有液体进入加样器内的严重污染，可以将加样器拆开后进行清洁，具体拆开步骤参照加样器说明书（不同的加样器的拆开方式有所不同）。3高压消毒，有的加样器的吸管部分可高压消毒（121，20分钟），如Eppendor的Resear

21、ch单道可调加样器。但消毒时不可超温超时，也不能挤压放置，以免造成变型。,定期校准：有资质的服务商提供校准服务，并贴已校准标签。,AIDS,confirmation laboratory,艾滋病确证实验室,AIDS,confirmation laboratory,艾滋病确证实验室,海恩法则,“每一起严重事故的背后，必然有29次轻微事故和300起未遂先兆以及1000起事故隐患。” 德国人帕布斯海恩（德国飞机涡轮机的发明者 ）,两点：一是事故的发生是量的积累的结果；二是再好的技术，再完美的规章，在实际操作层面，也无法取代人自身的素质和责任心。,“祸之作，不作于作之日，亦必有所由兆。”,细节决定结果态度决定成败,谢谢！,