中药质量生物控制模式和方法的研究.DOC

1、1中药质量生物控制模式和方法的研究板蓝根抗病毒效价检测方法的建立李寒冰 1，2 ，肖小河 1 *，鄢丹 1，魏丽 1，2 ，罗云 1，2（1解放军第三 0 二医院/全军中药研究所，北京 100039；2成都中医药大学药学院，四川 成都 610075）摘要 目的：考察板蓝根体外抑制流感病毒神经氨酸酶（NA）的活性，在此基础上建立板蓝根抗病毒生物效价检测方法，用于板蓝根质量生物控制。方法：采用荧光分光光度法检测板蓝根抑制 NA 的活性，优化检测条件，以对比检定概率单位（44）法设计试验，测定板蓝根抗病毒效价。结果：板蓝根有明显体外抑制 NA 的，量效曲线与阳性对照药达菲相同。反应率经概率单位转换后

2、，剂量（D）对数与反应函数（Y）呈良好的直线关系（Y8.73 + 1.22Log(D)，R=1） ，重复性考察 RSD=5.78%，表明该反应线性好，测量精密度高。对 10个批次板蓝根药材的抗病毒效价进行实际测定，结果均通过可靠性检验，表明本方法测定结果可靠。结论：板蓝根具有体外抑制流感病毒神经氨酸酶活性，经方法优化及实际检测，所建立的生物效价检测方法可以作为板蓝根质量生物控制方法。关键词板蓝根；抗病毒活性检测；神经氨酸酶；生物效价现行中药质量控制模式基本上是参照化学药的模式，以指标性成分的定性定量鉴别为主。然而中药化学成分十分复杂，多数中药药效物质并不清楚，指标性成分往往不是主要有效成分，其

3、含量多少与临床疗效关联不大甚至无关联。这种“惟成分论”的质控模式难以客观有效地评价中药质量，也难以体现中药防病治病的本质和特点。为寻求解决中药质量控制问题的新突破笔者所在课题组领衔肖小河研究员首次提出：建立中药质量生物控制模式和方法，从常规、化学和生物活性多重角度共同把关中药质量，创新和完善中药质量控制方法体系 1。中国药典2010 年版编制大纲业已指出：“中药质量标准要逐步由单一指标性成分定性定量测定向活性有效成分及生物测定的综合检测过渡” 2。可见将生物活性测定法引入到中药质量控制和品质评价中来，是中药质量控制模式和方法研究的重要发展方向。然而，质量控制不同于药效研究，所用方法除了要求疗效

4、相关外，更应满足定性/定量准确、灵敏快捷、简单、重现性好等基本要求。因而优选和建立适宜的生物活性检测方法是中药质量生物控制模式的关键点和难点。板蓝根（ RADIX ISATIDIS）是常用中药，临床应用广泛、在用于防治流感等病毒性疾病时往往取得较好临床效果，其抗流感病毒的药理研究也多见报道 3-6，抗流感病毒作用是板蓝根的主要功效之一。流感病毒神经氨酸酶（NA）活性体外检测的方法已成为国内外抗流感药（包括植物药）的重要筛选方法之一 7。该方法以检测药物对 NA 活性的影响来表征其抗流感病毒活性的强弱，具有客观、灵敏、快捷、稳定、重现性好等特点。研究表明：板蓝根具有体外抑制 NA 的生物活性，I

5、C 50约 0.90g（生药）L -1，其活性强度随品质差2异而呈现差异性。本文按照生物检定的要求设计检测方法，通过对比检定，结果可对板蓝根的质量和品质进行评价，有关研究结果如下。1 仪器与材料1.1 药材及试剂板蓝根药材，经解放军中药研究所肖小河研究员鉴定均为来源于十字花科（Cruciferae）植物菘蓝 Isatis indigotica Fort. 的干燥根。达菲胶囊(Oseltamivir phosphate Capsules)，批号：B1212，Roche pharma(Schweiz)。工作对照品：板蓝根对照药材（中国药品生物制品检定所）制成醇提取物（得率 7.70%）。NA 底物

6、：4-methylumbelliferyl-N-acetyl-D -neuraminic acid(MUNANA，Sigma)。1.2 主要仪器FLUOstar OPTIMA 荧光酶标检测仪，德国 BMG 公司；型生物安全柜，NUAIRE 产品；96 孔荧光酶标板，美国 COSTAR 公司。1.3 细胞系、病毒株及 NAMDCK细胞、流感病毒（A/PR8/34）：军事医学科学院微生物传染病研究所冻存。NA的制备：参照文献方法 8,9，进行MDCK细胞传代培养并接种病毒，待细胞完全被感染病变后取滤除细胞的病毒液，灭活，0.22m滤器滤过后分装，作为NA的原酶液，-70冻存。1.4 NA体外荧光检

7、测原理化合物MUNANA是NA的特异性底物，在NA作用下的产物4M（7-Hydroxy-4-methylcoumarin，C 10H8O3）在355nm入射波长激发下，可以产生460nm荧光，采用荧光检测器测定该波长荧光强度（Fluorescence Intensity）的变化，可以灵敏地反应NA活性 10；同样，如反应体系中加入抑制NA活性的药物，则荧光强度会相应减弱，从而该药物的NA抑制活性就能通过荧光强度的变化被表征。（图1）3Fig.1 Schematic diagram of fluorescence detection for NA in vitro activity2 实验方法2

8、.1 反应条件与加样方法2.1.1 样品制备取板蓝根药材粉末加乙醇超声处理1小时，滤过，取续滤液，回收乙醇并充分干燥，加水适量使溶解，微孔滤膜（0.22m）滤过，取续滤液按要求的剂距等比稀释成一定浓度的供试品溶液。另取工作对照品稀释成与供试品相同剂距的工作对照品溶液。2.1.2 反应条件参考已广泛应用的NA活性测定方法 10,11，将反应设置在96孔荧光酶标板中进行。先加入25l稀释的原酶液和25l样品溶液，室温下作用30min后加50l MUNANA，37 孵育60min后加入200l终止液终止反应，测定荧光强度值，设置激发波长：355nm，发射波长：460nm，测定温度37。为便于活性比较

9、，同时设样品测试组（NA+样品+MUNANA），背景对照组（样品+MUNANA，buffer补足至相同体积），酶活性对照组（NA+MUNANA，反应终止后再加入同体积样品溶液）。2.1.3 加样方法效价检测时根据预试验，通过比较对照品（S）与被检样品（T）的反应率估算被检品的效价（A T），在线性范围内调整被检样品浓度使与对照品活性接近，用概率单位（44）法在50%反应率上下设相同的浓度梯度，各组样品设复孔加样。根据各组荧光值（取复孔的平均值）计算各样品的抑制活性(2.2.1所列公式)。2.2 数据处理与效价计算2.2.1反应抑制率（ I）计算公式： I= %10背 景 荧 光酶 活 性 对

10、照 荧 光 样 品 作 用 后 荧 光酶 活 性 对 照 荧 光2.2.2反应率的概率单位转换由DAS ver1.0 软件统计完成。2.2.3效价计算：根据板蓝根抑制NA活性的量效曲线类型（图2-图4）和生物检定的统计学原理，确定采用“质反应的平行线测定法”进行对比检定。本研究中约定工作对照品的效价（P S）为1U/mg。效价计算：P T=RPS（式中：M=R，M则是S和T平行线之间平行于横轴的连线）。具体根据“质反应的平行线测定（44）法” 12效价测定原理编制的计算软件完成。2.2.4聚类分析以 SPSS13.0 for windows 软件完成。3 结果与讨论3.1 板蓝根抑制NA活性检

11、测和量效关系考察4板蓝根有体外抑制NA的药理活性 IC50=0.900.20g（生药）L -1。且量效曲线形状与阳性对照药相同（图2图4），提示两者作用趋势和规律相同。反应率与对数剂量之间呈良好的对称“S”形曲线，反应率转换成概率单位后，对数剂量与概率单位呈直线关系，在4.8810 -225mgml -1剂量范围内，回归方程Y8.7259+1.2169Log(D)，R=1。说明此反应类型适合用生物检定中“质反应平行线测定”法进行效价测定 12。Fig.2 Dose-effect relationship Fig.3 Log10 dose-effect relationshipFig.4 lin

12、ear relationship of log10dose-probit3.2 效价检测的方法学考察3.2.1 仪器精密度考察取工作对照品配成不同浓度溶液，点样于96孔板中参与酶促反应，结束后连续6次荧光扫描，计算每孔荧光值的变异系数。结果RSD值在0.5%1.5%之间，表明仪器精密度良好。3.2.2 重复性考察同一批样品分五次提取，制成供试品溶液，与工作对照品溶液进行对比检定，计算效价并求中间值的变异系数。RSD=5.78%，表明该方法具有较好的重复性。3.2.3 稳定性考察分别于 0h、1h、2h、3h、4 h 将冷藏保存于 4的同一供试品溶液进行效价检测，计算RSD 为 4.75%，结果

13、说明供试品溶液在 4保存条件下 4h 内是稳定的。3.3 不同批次板蓝根抑制流感病毒神经氨酸酶效价的测定以本文设定的工作对照品为参比，按照上述方法，测定10批板蓝根药材的效价，结果5如下（表1）：Table .1 Determination results of sampleReliability testNo. Source PT（U/g） FL% Deviation from straight linedeviation from parallel lineS1 Yutian,Hebei 23.07 32.51% 0.98 0.81S2 Qixin,Hebei 22.52 28.05% 0

14、.99 0.43S3 Yuanyang,Henan 29.55 27.85% 0.99 0.27S4 Longxi,Gansu 30.48 27.81% 0.99 0.84 S5 Fuyang,Anhui 1 29.01 31.31% 0.98 0.67 S6 Fuyang,Anhui 2 31.02 31.32% 0.99 0.83 S7 Fuyang,Anhui 3 29.76 19.06% 0.99 0.76 S8 Fuyang,Anhui 4 30.55 28.75% 0.98 0.82 S9 Bozhou market 1 8.28 44.83% 0.49 0.12 S10 Bozh

15、ou market 2 12.32 31.10% 0.35 0.62Note: *Reliability test: deviation from straight line P0.05, deviation from parallel line P0.05Fine quality Samples, identified by routine method (collected from the same GAP base)Inferior quality samples, identified by routine method (expired samples, got from mark

16、et)10个批次样品的检定结果表明，不同批次药材抗病毒效价值存在差异，以效价值建立的聚类树图可见（图5）：9、10号样品（常规鉴别为劣药、效价最低）首先聚为一类，与其它样品明显区别开来；接着1、2号样品（零散产地样品、效价较低）聚为一类与38号样品区分开来；58号样品为GAP基地药材与3、4号样品（常规鉴别为优等品，测得效价值最高）共同聚为一类。提示，抗流感病毒效价检测方法可以对板蓝根药材进行品质评价。Fig.5 Anti-virus potency cluster analysis of different samples4 结论板蓝根所含化学成分非常复杂，是典型的疗效确切，药效物质不明确的

17、中药。对其质零散产地样品劣药样品GAP 基地样品、个别产地优质药材6量控制，现版药典只是在常规性状鉴别的基础上采用茚三酮显色法检识精氨酸的有无。然而精氨酸并不是板蓝根的主要药效成分，也不是专属性成分，检识精氨酸的有无并不能客观、全面地评价板蓝根的质量。本文从生物测定的角度，直接关切板蓝根的抗病毒活性，建立了体外抗流感病毒神经氨酸酶活性的生物效价检测方法，研究结果表明：所建立方法 灵敏（每孔加样量相当于生药量约0.025g）、快捷（双人操作，整个检验过程可在2小时内完成）、 可重复（RSD=5.778%，n=5）、检定结果可靠（可靠性检验：偏离直线 P0.05、偏离平行P0.05）。该方法用于板

18、蓝根的质量生物控制和评价，不用过分关注个别成分，能够体现板蓝根药效特点，一方面提高板蓝根自身质量控制水平，另一方面为其它有效物质不清楚中药质量的生物活性（效价）控制研究提供参考。参考文献：1 肖小河,金城,赵中振，肖培根，王永炎.论中药质量控制与评价模式的创新与发展.中国中药杂志，2007，32（14）：1377-13812 王平，钱忠直.中国药典2010年版编制大纲解读.药物分析杂志,2008，28(2):337-3403 YANG Haixia, LI Xiao-mian, 2007. Effect of extractive of Radix Isatidis on influenza

19、virus. JOURNAL OF TIANJIN MEDICAL UNIVERSITY.13,19-224 HU Xingchang，ZHENG Weiqiang. Resistance to lsatia indigotica Fort Lectin Inhibit Influenza Virus. Journal of Shanghai Teachers University ( Natural Sciences ). 2003,32(1):62-655 刘盛,陈万生,乔传卓,等.不同种质板蓝根和大青叶的抗甲型流感病毒作用.第二军医大学学报,2000,21(3):204-206.6 肖珊

20、珊,金郁,孙毓庆.板蓝根化学成分、药理及质量控制研究进展.沈阳药科大学学报, 2003,20(6):455-459.7 彭勇，李文魁.国外抗流感病毒植物药研究近况.国外医药植物药分册，1999，14(1):7-9.8 CANN A J. Virus Culture A Practical Approach. New York: Oxford University Press. 1999.9 Deba Prasad Nayaka and Udo Reichl, 2004. Neuraminidase activity assays for monitoring MDCK cell culture

21、 derived influenza virus. Journal of Virological Methods. 122, 9.710 Potier M, Mameli L. Fluorometric assay of neuraminidase with a sodium (4-methylumbelliferyl-(-D-N-acetylneuraminate) substrate. Anal Biochem, 1979,94: 287.11 Deba Prasad Nayaka and Udo Reichl, 2004. Neuraminidase activity assays for monitoring MDCK cell culture derived influenza virus. Journal of Virological Methods. 122, 915.12 周海钧.药品生物检定.北京：人民卫生出版社，2005：127-135.基金项目 国家杰出青年科学基金项目（30625042） ；国家“十一.五”科技支撑计划课题（2006BAI08B03）作者简介 李寒冰（1973-） ，男，药学博士，主要从事中药质量控制研究。Tel:13439093021E-mail:*通讯作者 肖小河 Tel:(010)66933322 E-mail: