1、组织学技术概述、切片制备,付文玉2008.9.10,概 述,光镜技术石蜡切片术（paraffin sectioning）苏木精-伊红染色,简称HE染色（hematoxylin-eosin staining）,HE染色，脑垂体,扫描电镜术（scanning electron microscopy,SEM）：观察组织细胞表面结构,电镜技术,透射电镜术（transmission electron microscopy,TEM）：观察细胞内部结构,Transmission Electron Microscope,浆细胞,血细胞,组织化学技术,一般组织化学 （Classical histochemist
2、ry） 免疫组织化学 （immunohistochemistry） 原位杂交 （in situ hybridization),兔肝PAS反应,图像分析术-形态计量术,应用数学或统计学原理对组织切片提供的平面图像进行分析，从而获得立体的组织和细胞内各种有形成分的数量、体积、表面积等参数，从量的角度显示结构和功能的关系。,细胞培养术和组织工程,细胞培养术：把从机体取得的细胞在体外模拟体内的条件下进行培养的技术。,组织工程：细胞培养术在体外模拟构建机体组织或器官的技术。,实验中的组织工程耳,石蜡切片的制备,基本操作步骤,取材、固定,洗涤、脱水,透 明,浸蜡、包埋,切 片,染 色,脱水、透明、封片,一
3、、取材、固定,1.动物致死法,麻醉 空气栓塞 颈椎脱臼或断头 股动脉放血,（一）取材,2.动物选择,根据教学或科研目的和要求确定。,3.取材方法,取材顺序 先腹腔，后胸腔、盆腔，最后取神经系统,肌组织：纵切后结扎固定，以防因收缩而出现波浪形变化。取纵、横切面；肝脏：右前叶或左外叶中部。纵切或冠状切面；胆囊：取胆囊体部，附于滤纸，洗去胆汁后固定；,组织、器官取材举例,胰腺：取含有较多胰岛的胰尾部。胃：取胃底或胃体。附于滤纸，防止卷缩；肾脏：纵剖，再做扇形切面，皮、髓质均有。,4.外科活体组织取材,临床手术取材：多用于肿瘤组织。包括肿瘤及其周围组织；活体小组织：包埋时注意切片的面，因体积较小，仔细
4、操作,5.取材注意事项,动作轻、快，保证组织新鲜; 保持组织清洁; 力求组织块小而薄; 一刀切取，避免挤压; 尽量保持组织原有形状; 部位准确，切面合适; 切除不需要的部分,（二）固定,1.意义和目的,使要观察的组织结构尽量接近于生前的正常状态。,防止组织细胞死后的变化和自溶； 使细胞内的可溶成分转变为不溶性物质； 使细胞内成分沉淀、凝固后产生不同的 折射率和对染料的亲和力； 增加组织硬度，利于切片； 防止组织过度收缩或膨胀,2.注意事项,动作迅速，保持组织新鲜； 防止组织因固定而发生变形； 使用新配制的固定剂； 固定剂的用量:组织块体积的10- 15倍 ；,固定的时间依组织的种类、性质、大小
5、、固定剂的种类、性质、渗透力而定；固定过程中时常摇动；作好记录，组织名称、固定液、时间等,3.固定液的种类,单纯固定液 甲醛、乙醇、苦味酸、丙酮、氯化汞、等,混合固定液 Carnoy液、Bouin液、Zenker液等,4.固定的方式,特殊固定法,常规固定法,二、洗涤、脱水、透明、浸蜡、 包埋,方法固定液以水配制者流水冲洗；固定剂含乙醇者不冲洗，或用与固定剂中乙醇浓度相近的乙醇冲洗；特殊固定液洗涤法,（二）脱水,目的和原则 用某些溶剂逐步将组织块吸收的水分置换出来，以利于透明剂和石蜡或火棉胶的渗入。,种类和效果 非石蜡溶剂的脱水剂：乙醇、丙酮等脱水兼石蜡溶剂的脱水剂：正丁醇和环氧六烷等,（三）透
6、明,目的 便于透蜡包埋。大多数脱水剂与石蜡不相混合，通过透明剂的作用才能透蜡。,种类 二甲苯、苯、甲苯、氯仿等。,（四）浸蜡（透蜡）,目的和方法 脱水、透明后的组织用石蜡、火棉胶、明胶等支持剂透入其内部，替代组织中的透明剂，并渗入组织内部使软组织变为适当硬度的蜡块，以利于切片和观察。,浸蜡剂的种类 石蜡、火棉胶、明胶等,（五）包埋,1.石蜡包埋法常用的方法,浸蜡,54-56,56-58,2.快速石蜡包埋法用于快速诊断,包埋过程,包埋注意事项,3.火棉胶包埋法用于大块组织和眼球,4.碳蜡包埋法、明胶包埋法不常用,三、组织制片法-切片,（一）石蜡切片法,1.切片前的准备工作,载波片的处理；防脱片剂
7、的选择；修块；备刀,2.切片过程,3.石蜡切片常遇到的问题及解决的方法,4.切片注意事项,（二）冰冻切片法,1.制备石蜡切片的基本步骤。2.组织取材和固定的注意事项。,思考,四、染 色,将染料配成溶液，将组织切片浸入染色剂中，使组织、细胞等成分被染上深浅不同的颜色，产生不同的折光率，便于在光镜下观察。,1.目的,2.染料特性,染料是有机化合物，在其分子结构中有特殊功能的基团，发色团和助色团。,4.常规染色技术HE染色,苏木精（Hematoxylin）为碱性染料，能将细胞核染成蓝色 ；伊红（Eosin）为酸性染料，常将细胞质染成红色,HE染色的步骤和方法,蓝化,充分水洗,分色,伊红染色,水洗,脱
8、蜡,苏木精染色,水洗,复水,水洗,脱水,透明,封片,脱蜡： 二甲苯I、II，脱蜡必须彻底；复水：梯度酒精，洗去溶解的石蜡和二甲苯；水洗：普通水洗，蒸馏水洗；苏木精染色：染色时间10-15min；水洗：普通水洗净染液；分色：盐酸酒精分色，将过染或不需 要染色的组织成分除去；水洗：普通水洗净染液；,氨水蓝化：使细胞核进一步变蓝；充分水洗：洗去盐酸酒精，终止其褪色作用；伊红染色：染细胞质，时间勿长；脱水：梯度酒精，一定要彻底；透明：二甲苯I、II，确保切片完全透明；封片：中性树胶,HE染色注意事项,脱蜡必须彻底；梯度酒精复水；苏木精染色时间依染液新旧、 切片厚薄、温度灵活掌握；分色是染色成败的关键；分色后水洗要充分；伊红染色要适中；封片前脱水要彻底,小 结,制备石蜡切片的基本步骤。组织取材和固定的注意事项。HE染色的操作步骤和注意事项。,
