细胞培养基本知识基本技术.ppt

1、细胞培养的基本知识、基本技术,医学院中心实验室谷景义85225841,主要内容：,1、细胞培养基本知识2、培养细胞生长环境3、细胞培养基本技术4、培养细胞质量控制,一、 细胞培养,把取得的组织用机械或消化的方法分散成单个细胞，用培养基制成细胞悬液，在体外适宜条件下，使细胞生长繁殖，并保留其一定的结构和功能特性。,培养细胞的特性1 -生长方式及类型,贴附型、悬浮型,培养细胞的特性2 - 增殖特点,体外培养的细胞既保持了一定的体内细胞的基本特性，但也具有本身的一些特点。贴附-伸展接触抑制-增殖的密度抑制,贴附-伸展,接触抑制,当一个细胞被其他细胞围绕导致无处可去而保持接触时，细胞不再移动，在接触区

2、域的细胞膜活动将停止。因此，一般正常细胞并不相互重叠于其上生长。,细胞增殖密度抑制,当细胞生长汇合形成单层时，细胞变得比较拥挤，这时其分裂停止，这种细胞可在静止状态下维持存活一段时间，但不会继续分裂生殖。转化细胞或恶性肿瘤细胞与正常细胞不同，他们的接触抑制和增殖密度抑制常常降低，因而可以增殖至较高的终末细胞密度。,培养细胞的特性3 -生长过程,单个细胞增殖：细胞周期,高等生物体，细胞周期时间的长短变化主要集中在G1期，S，G2和M期基本保持稳定。 Hela 8-16h 5-9h 2-8h 20-28h,一群细胞的增殖：细胞生长曲线,接种后，每天进行检测计数，以细胞数为纵坐标，以时间为横坐标，绘

3、制成曲线。测定细胞绝对生长数的常用方法，也是判定细胞活力的重要指标，是培养细胞生物学特性的基本参数之一。饱和密度：在特定条件下，培养器皿内能达到的最高细胞数，当细胞达到饱和密度后细胞群体停止繁殖。,潜伏期/滞留期指数增长期平台期/停滞期退化或死亡,细胞系的生长过程细胞系：原代培养细胞经首次传代成功后即成为细胞系，可泛指一般可以传代的细胞。细胞株：通过筛选或克隆化，从原代细胞或细胞系中获得具有特殊性质或标志物的细胞。细胞系亚系：由某一细胞系分离出来，在性状上与原细胞系不同的细胞系，称该细胞系的亚系,有限细胞系（Finite cell line）如果不能继续传代或传代有限，可称为有限细胞系。连续细

4、胞系（Continuous cell line）能够连续传代的细胞叫做“连续细胞系或无限细胞系。可培养50代以上并无限培养下去。大多数的二倍体细胞为有限细胞系。无限细胞系大多已发生变异。,原代细胞：从机体取得组织材料，在体外培养生长，到第一次传代前。传代细胞：当原代细胞持续生长繁殖一段时间，达到一定的细胞密度后传代的细胞。,培养瓶培养法,方法： 将培养对象直接接种于培养瓶内，再放入培养箱进行培养。,优点：1、可以避免培养瓶表面粗糙等原因对培养物的影响。2、可以方便地进行显微镜观察、染色等操作，以及永久保存。3、增加了培养瓶的培养面积。,培养板培养法,方法：将培养细胞接种在培养板的孔内，然后在C

5、O2培养箱内培养。应培养量较小也称为微量培养。,悬滴培养法也称植块悬滴培养法，是最早建立的体外培养技术,基本要点：将组织或器官植块接种在一张盖玻片上，滴上一滴培养液，然后翻转盖玻片使植块及营养液悬挂在盖玻片下，再放置于一凹形载片之上，最后用溶蜡密封后放入培养箱中培养。,1907 年 -Harrison用细胞培养解决一个难题盖玻片覆盖凹型载玻片悬滴培养法,悬滴培养法基本步骤,1、在盖玻片上滴加胚胎提取液、血浆和植块，混匀。培养基凝固后将植块包埋。,2、在凹载片周围涂凡士林。将凹载片向下压向盖玻片,3、将凹载片反转，盖玻片周围涂溶蜡。放入培养箱培养,1910 至 1923年 Carrel 和早期的

6、组织培养卡氏瓶培养法,1943年Earle、Dulbecco等创建单层细胞培养法，首建长期传代的L-细胞系。1951年Gey首建人肿瘤细胞Hela细胞系。从50年代末开始，组织培养技术应用进入了一个繁盛的阶段，广泛应用于生物学和医学研究各个领域。,无血清培养,无血清培养基:是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。但是它们可能包含个别蛋白或大量蛋白组分。基本成分为基础培养基及添加组分两大部分。观察一种生长因子对某种细胞的作用，这时需要排除其他生长因子的干扰作用。而血清中可能含有各种生长因子；又如需要测定某种细胞在培养过程中分泌某种物质（抗体、生长因子）的能力；或者要大规

7、模的培养某种细胞，以获得它们的分泌产物。往往针对性很强，价格偏高。,三维细胞培养技术,将具有三维结构不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养, 使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长, 构成三维的细胞-载体复合物。,普通的细胞培养由于细胞在体外改变的环境下增生逐渐丧失了原有的性状，往往和体内情况不相符，而动物实验完全在体内进行, 但由于体内的多种因素制约以及体内和外界环境相互影响而变得复杂化, 难以研究单一过程，且难以研究中间过程。三维细胞培养技术是介于单层细胞培养与动物实验之间的一种技术，既能最大程度的模拟体内环境，又能展现细胞培养的直观性及条件可控性的优势。应用：软骨和骨组

8、织（软骨细胞和干细胞，再生损伤的软骨、骨）循环系统和心脏（有目的地改变血管形成）,目前常用的三维培养模型： 基质覆盖培养 旋转烧瓶培养 微载体培养 预置支架培养 旋转细胞培养系统 自发性细胞聚集,细胞培养技术的特点及应用,优点：1）研究的条件可以人为控制2）研究的样本均一3）研究内容方便观察、检测、记录4）研究的费用相对于经济缺点：体外培养的细胞不能完全等同于体内的细胞。,应用,病毒学：病毒鉴定，病毒抗原作用，疫苗生产 免疫学：杂交瘤-单克隆抗体遗传学：染色体分析肿瘤学：筛选重要的抗肿瘤药物分化及发育：刺激使细胞群体发生改变细胞毒实验：药效测试临床医学及生物技术：干细胞培养定向诱导分化后移植；

9、组织工程软骨损伤修复；试管婴儿,二、培养细胞生长环境,Substrate,Gas,Medium,Serum,GlassPlasticCultureVessels,O2CO2,pHOsmolalityTemperature,StorageAt 4,Supplements,FBSNCS,HormonesGrowth factorsAntibiotic,Cell Culture Environment,1 、细胞的营养需求,（1）氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子（2）促生长因子等 完全培养基的组成： 基础培养基 80一95 血清 5一20 碳酸氢钠 2.0 g/L 青、链霉素 各100单位毫升,

10、基础培养基的选择,参考： (1）建立某种细胞株所用的培养基应是培养这种细胞首选的培养基。可以查阅参考文献，或在购买细胞株时咨询。 (2) 其它实验室惯用的培养基不妨一试，许多培养基可以适合多种细胞。 (3) 用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是最客观的方法，但比较繁琐。常用的培养基种类RPMI-1640（标准型）、DMEM-高糖（标准型）、DMEM-低糖（标准型）、DMEM-F12 等,血清,热灭活：56, 30 分钟加热已完全解冻的血清(目前少用）热灭活目的：灭活血清中的补体成分。如果不做细胞因子和免疫相关的实验，建

11、议血清不要灭活。 热处理造成血清沉淀物增多，影响血清质量。甚至严重影响细胞生长速度，且细胞贴壁率降低。血清中的沉淀物絮状物：血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成，这些絮状物不会影响血清本身的质量。可用离心3000rpm, 5 分钟去除，也可不用处理显微镜下“小黑点”：经过热处理过的血清，沉淀物的形成会显著增多。有些沉淀物在显微镜下观察象“小黑点”，常误认为血清受污染。一般情况下，此小黑点不会影响细胞生长，但如果怀疑血清质量，则应立即停止使用，更换另一批号的血清,血清质量好坏是实验成败的关键。常用血清： 胎牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，以胎牛血清质量最好。优质血清的标准： 透明，淡

12、黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。,pH 调整液,NaHCO3 溶液（碱）常用浓度为7.5%。配制时用三蒸水溶解后，过滤除菌或高压灭菌，分装，4保存HEPES（分子量238.31）溶液一种弱酸，羟乙基哌秦乙硫磺酸，对细胞无毒性主要作用:防止培养基pH迅速变动。 在开放式培养条件下，观察细胞时培养基脱离了5%CO2的环境，CO2气体迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此时可以维持pH7.0左右。一般在进行克隆化培养时要添加HEPES使用终浓度一般为10-50mmol/L常配成1M 储存液：用20ml 双蒸水溶解4.76克HEPES，过滤除菌或高压灭菌，分装小瓶，4保存。使用时可向1

13、00ml培养液中加入2ml HEPES浓缩液，终浓度为20mmol/L,抗菌素的使用： 在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。 通常是青霉素和链霉素联合使用。 最终使用浓度为每毫升100单位。,制备1000ml RPMI1640培养基,RPMI1640干粉培养基10.4g（1包） 超纯水400ml 磁力搅拌至完全溶解 加超纯水定容至1000ml 在超净台内无菌条件下，用灭菌后的并置有 0.22m 孔径滤膜的过滤器除菌，分装200ml/瓶，-20保存备用。 用前取一瓶溶解，每200ml培养液加灭活的小牛血清至终浓度为10%，即加22ml。加青霉素和链霉素至终浓度各为

14、100U/ml。,消化液,分离组织和分散细胞常用：胰蛋白酶、二乙胺四乙酸二钠(EDTA) 单独或混合使用,胰蛋白酶溶液： 胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。 胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。 胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。 用含血清培养液终止其对细胞的消化作用,胰蛋白酶粉末置烧杯中，用少许D-Hanks 平衡盐溶液调成糊状，再补足D-Hanks 平衡盐溶液（常用浓度为0.25% ）搅拌混匀，置室温 4 小时或冰箱过夜，不断搅拌振荡次日，先用滤纸粗滤，再进行过滤除菌，分装入瓶中， -20保存备用（以免分

15、解失效），胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可用碳酸氢钠溶液调 pH 至7.2 左右,胰蛋白酶溶液配制,EDTA4Na 溶液,一种化学螯合剂，对细胞有一定的离散作用，而且毒性小，价格低廉，使用方便常用工作液浓度为0.02%。注意：使用EDTA 处理细胞后，要用平衡盐液冲洗干净，因残留的EDTA 会影响细胞生长,D-Hanks 平衡盐溶液(D-Hanks Balanced Salt Solutions, D-HBSS),2、 生存环境,细胞培养必须具备细胞生存并繁殖的生理学能接受限度内的物理化学特性（1）温度（2）气相（3） PH,温度,体外培养的细胞需要在保持一定恒温的环境中才能生长。在达到最适温度（3

16、7）前，一般细胞繁殖率因温度的升高而增加，但是，温度逐步升高并超过最适温度时，繁殖会被抑制。当温度在25- 35，细胞的生长速度很慢，但能够生存；细胞在4也能存活数天；只要温度不低于0，细胞都能生存；加了保护剂还能放到液氮中保存。当高温时，在41- 42中培养1h，细胞损伤严重，43以上，则多数细胞死亡。高温比低温对细胞的影响更为明显。,气相和PH,5% CO2 + 95%空气混合气体（O2）。CO2既是细胞生长所需，同时又是细胞代谢的产物，并与维持培养基的PH有关。最适PH 7.2 7.4 低于PH 6.8或高于PH7.6可能对细胞有害，甚至死亡。,酚红指示剂：黄 6.6 橙 8.0 红,3

17、、无毒无污染,无 毒：无毒是培养细胞的必需条件。凡与 细胞直接或间接接触的东西都必须 是无毒的。若具细胞毒性，细胞容 易导致死亡。因此，选用器皿和材 料时必须注意。,体外培养的细胞缺乏机体免疫系统，无防御能力，一旦发生细菌等污染，细胞最终会死亡。交叉污染容易使细胞系失去原有特性。,Cell Culture Basic Technique,Primary Culture,Passage Culture,三、细胞培养基本技术,selection,cloning,Cell Culture,Cell Line,Cell Strain,1.Primary Culture,Continuous cell

18、line,Finite cell line,subculture,原代细胞培养,原理：将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胶原酶）或组织贴壁法处理，得到单个细胞或细胞群，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。仪器、材料及试剂：CO2培养箱，培养瓶、平皿、烧杯、吸管、移液枪、手术器械、计数板、离心机、水浴箱（37）1640/DMEM F12培养基（含10%血清）， 2%胶原酶II，PBS，酒精,组织消化法,1.准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒30分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。2.处理组织：采集的标本必须在4H内完成。取出6-10cm长

19、脐带，置于烧杯或平皿中，用PBS液漂洗23次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中3060分钟。,3.剪切：用手术剪将组织块剪成23立方毫米大小，然后再用眼科剪把组织剪细成1立方毫米的小块，以便于消化。加入与组织块总量1：1的2%胶原酶II，然后一并倒入瓶中，封口。4.消化：或用恒温水浴，或置于37温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。37 空气摇床100转/min，1.5-2h,5.分离：待组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，并倒入至少5倍体积的PBS稀释消化液，随即通过200目的不锈钢

20、筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。2500rmp离心消化20分钟，吸出上清，加入8-10ml PBS，1000rmp离心5min，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。6. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。7.换液：24-48H后观察细胞是否贴壁，如已有部分细胞贴壁，可换液继续培养。,Monolayer Culture,Suspension Culture,2.Passage Culture,Epithelial cellsBreastCervixKidney,FibroblastsMesenchgmal cell(间质细胞）Connective t

21、issueMuscle tissueEndothelium tissue,Neurectodermal cellsNeurones（神经元）Glia(神经胶质）,Tumor cells,Lymphocyte,Hybridoma,Transformedcells,2、传代细胞培养,传代前的准备1. 酒精，棉球，镊子，杂物盒，试管，吸管筒，离心管，培养瓶或板，计时器，笔2. 0.25%胰蛋白酶3. 含血清培养基，PBS,传代步骤（贴壁细胞）：1. 镜下观察细胞生长至融合状态2. 吸出旧的培养液，用无血清培养液或PBS清洗两次（切记要清洗干净）。3. 消化细胞：最常用的方法是在培养瓶中添加1ml 0

22、.25%含EDTA的胰酶，培养箱中37消化5-15s。可根据不同的细胞类型调整消化时间及程度。 在电镜下观察，当细胞突起回缩，细胞之间间隙增大，细胞近乎缩成圆形即可。,4. 终止消化：立即加入含有血清的培养基，用吸管吹打分散细胞，吹打动作不可过猛，力度要适中，否则容易损伤细胞并产生能伤害细胞的气泡。5. 1000rmp离心5min，弃上清。6. 用培养液重悬细胞，计数并调整细胞密度。,Virus infection,Expression products,3.Specific Culture,Cloning Culture,Selection Culture,Cytotoxicityassay

23、,Cell Strain,无菌操作中的注意事项,在无菌操作中，一定要保持工作区的无菌清洁操作前,无菌室及无菌操作台以紫外灯照射30 分钟灭菌，以75% 或70% ethanol 擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟操作时，小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45角取用 操作过程中注意，有菌意识，无菌操作！,基本操作,1、原代细胞培养2、传代细胞培养3、培养细胞生长状况的观察4、细胞冻存、复苏、运输,培养细胞生长状况的观察,常规观察：培养液颜色（是否变黄）生长增殖变化（经历到

24、哪个时期，长满否）形态变化（透明度、折光性、细胞轮廓）微生物污染（细菌、霉菌）可用显微镜观察活细胞及其动态,培养细胞生长状况的观察,细胞计数：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。（细胞生长曲线图）,全自动细胞计数仪是一款配备了最先进的光学和图像分析软件，可以快速对悬液之中的细胞进行评估的台式细胞分析平台。现如今，随着其具备了荧光应用能力明场和两路荧光光学通道，研究人员可以用之进行细胞计数、监测荧光蛋白表达以及测定细胞活力。http:/ 台盼蓝法0.5克 台盼蓝加热溶于100毫升BSS液中（PH7.2-7.4）。细胞悬液和

25、染液按1：1体积比混合后加盖玻片，1分钟后计数细胞。活细胞圆形透明，死细胞染成蓝色，用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活力。,培养细胞活力的测定,1.将计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板。2.将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间，静置3min，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。 3.计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按公式计算：细胞数/mL=四大格细胞总数/4104说明：公式中除以4，因为计数了4个大格的细胞数。公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为：1.0mm（长）1.0mm（宽）0.1mm（高）=0.1mm3而1ml=1

26、000mm3（注意：镜下偶见有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液,细胞冻存、复苏及运输,及时进行细胞冻存十分必要：细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。细胞冷冻储存在-70冰箱中可以保存3个月到一年之久；细胞储存在液氮中，温度达-196，理论上储存时间是无限的。,原理：,细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用二甲基亚砜或甘油作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，

27、减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法。这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。,冻存步骤,1. 配制含10%DMSO或甘油、1020%血清的冻存培养液；2. 取对数生长期的细胞，用胰酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中；3. 离心1000rpm，5min；4. 去除胰酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5106/ml1107/ml；,5. 将细胞分装入冻存管中，每管11.5

28、ml；6. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；7. 冻存：标准的冻存程序为降温速率 -1-2/ min；当温度达-25以下时，可增至-5-10/min；到-100时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入4 冰箱0.5h， -20冰箱2h ，-70冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。,复苏步骤,1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37温水中，并不时摇动令其尽快融化。2. 从37水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；3. 离心， 1000rpm，5min；4. 弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞

29、密度，接种培养瓶，37培养箱静置培养；5. 次日更换一次培养液，继续培养。,培养细胞的运输,冷冻储存运输：利用特殊容器内盛有液氮或干冰冻存，保存效果较好，但比较麻烦，且不宜长时间运输。充液法：选择生长状态良好的细胞，充满培养液到瓶颈部，保留微量空气，用棉花包装做防震防压处理。也可放贴身口袋，一般4-5天都能存活，距离近者还可倒掉培养液直接放口袋运送。,四、培养细胞质量控制,常见问题：微生物感染，特别是支原体感染，3060% 错误细胞：被其他细胞交叉污染；鉴定错误的细胞； 分类错误的细胞， 15%过度传代引起遗传/表观遗传的变异或漂移变异克隆形成,形成原因,操作技术不够严格、不正确，共用试剂、忘

30、记更换滴管、多种细胞同时操作,细胞来源不可靠，引进了错误细胞，从其他实验室引进了过度传代细胞,操作疏忽,共培养体系应用,交叉污染细胞使用的后果,结果错误 Erroneous results: 浪费 Wasted research money推迟成果Potential delay in discovery,错误细胞使用,2000-2004：HeLa污染细胞的使用，19/Int 407; 45/WISH; 59/Chang liver; 470/Hep-2; 556/KB; 2004(Buehring ), pubmed 220篇使用细胞的文章中, 32% 用HeLa细胞, 仅33%验证了其身份,

31、 35% 的从其他实验室引进NCI所使用的 60种用于筛选抗癌药的细胞中 ADR-RES 实际是OVCAR-8. 在300 篇论文中用过,Ecv-304,“人脐静脉内皮细胞”,日本实验室建立，ATCC、DSMZ等机构有保藏，在2000年，经STR检测，证明为T24(膀胱癌)，各自网站有公布。在实验室间广泛传播，2006y,全世界600余论文，利用该细胞进行研究，2/3在中国。Why?Do not know? No other suitable cellular modelExpensieve, can not afford, have to compromise,如何避免,知名保藏机构引进已检

32、定的细胞（国家实验细胞资源共享平台）支原体检测，定期进行每次操作一种细胞不同细胞培养液分开使用使用抗生素预防及时准确做好标记,注意：废弃物处理,首要原则：所有感染性材料必须在实验室内清除污染、高压灭菌或焚烧。 用以处理潜在感染性微生物或动物组织的所有的实验室物品，在被丢弃前应考虑的主要问题有： 1、是否已采取规定程序对这些物品进行了有效的清除污染或消毒？ 2、丢弃已清除污染的物品时，是否会对直接参与丢弃的人员，或在设施外可能接触到丢弃物的人员造成任何潜在的生物学或其他方面的危害？ 3.清除污染 高压蒸汽灭菌是清除污染时的首选方法。需要清除污染并丢弃的物品应装在容器中。任何高压灭菌后重复使用的污染（有潜在感染性）材料不应事先清洗，任何必要的清洗、修复必须在高压灭菌或消毒后进行。 也可采用其他除去或杀灭微生物的替代方法 4.污染性材料和废弃物的处理和丢弃程序 要对感染性物质及其包装物进行鉴别并分别进行处理，相关工作要遵守国家和国际规定。,谢谢！,下午请带白大褂过来！,