蛋白质组学技术及其在低剂量辐射生物效应中的应用.ppt

1、蛋白质组学技术及其在低剂量辐射生物效应中的应用,主要内容,20世纪三大科学计划：曼哈顿原子弹研制计划、阿波罗登月计划、人类基因组计划(HGP)HGP是由美国学者1985年在美国能源部的一次会议上讨论，并由诺贝尔奖获得者Renato Dulbecco 于1986年在Science 杂志发表的一篇文章中提出的.其目的是阐明人类基因组30亿个碱基对的序列，发现所有人类基因并阐明其在染色体上的位置，从而在整体上破译人类遗传信息。该计划启动于1990年，原定15年完成，由于技术的成熟与基因组测序的规模化运作，以及来自商业竞争方面的压力，2000年6月26日基因组序列草图测序完成。,人类基因组以及多种模式

2、生物、重要生物基因组全序列的完成，标志着生命科学研究进入所谓的“后基因组时代 (Postgenome era)”, 即产生了功能基因组学（Functional Genomics）,结构基因组学：以全基因组测序为目标；“静态的”功能基因组学：以基因功能鉴定为目标，又称后基因组研究；“动态的”,转录组学蛋白质组学代谢组学表型组学相互作用组 ,功能基因组学,蛋白质组(proteome) PROTEOME = PROTEin +genOME 最早是由澳大利亚学者Wilkins和Williams等人于1994年提出，并首次公开发表在1995年7月的Electrophoresis杂志上，指的是由一个细胞、

3、一个组织或是一种生物的基因组所表达的全部相应的蛋白质。 蛋白质组学（Proteomics） 指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学，其目的是从整体的角度分析细胞或组织内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。,蛋白质组与基因组相对应，也是一个整体的概念，是基因组表达的全部蛋白。但两者又有根本的不同之处 基因组是静态的，一个有机体从它的发生、发展到衰老、死亡，不同细胞、组织和器官的基因组是基本稳定不变。蛋白质组作为基因组表达的产物随时间、地点、环境等条件变化，是一个动态的概念。 在人类基因组计划中大约有30,000个

4、基因被鉴定出来。一个基因=平均4个左右的剪接变异体，约120,000或更多的独立蛋白。翻译后修饰和蛋白相互作用，蛋白质组比基因组复杂10倍以上。,蛋白质组学与基因组学的联系与区别,Proteomics,生理病理过程的复杂性,研究技术的高通量性,人类蛋白质组正式启动,2001年成立国际人类蛋白质组组织（HUPO），2003.12.15启动两个首批行动计划， 2003成立了中国人类蛋白质组组织（CHHUPO）人类肝脏蛋白质组计划（HLPP）由中国军事医学科学院副院长贺福初院士领导，16国80多个实验室参加。中国第一次领导重大国际协作计划。人类血浆蛋白质组计划（HPPP）由美国科学家牵头，13国47

5、个实验室参加。,蛋白质组学的研究内容,在蛋白质水平上定量、动态、整体地研究生物体，它旨在阐明生物体全部蛋白质的表达模式及功能模式。 1）组成（表达）蛋白质组学了解某种特定的细胞、组织或器官制造的蛋白质种类；蛋白质表达谱（组织、器官、细胞、亚细胞分布等） 2）比较蛋白质组学寻找正常组织与异常组织蛋白表达差异 3）结构蛋白质组学描绘蛋白质的精确三维结构，揭示其结构上的关键部位，如与药物结合并且决定其活性的部位。 4）功能蛋白质组学蛋白质的功能和相互作用；明确各种蛋白质分子是如何形成类似于电路的网络； 5）蛋白质组学研究的技术平台与生物信息学分离、鉴定技术，分析软件和数据库。,蛋白质组学的研究技术,

6、蛋白质分离技术基于凝胶系统的分离技术双向凝胶电泳基于非凝胶系统的分离技术HPLC；毛细管电泳 蛋白质鉴定技术 Edman 测序 质谱技术；生物信息学技术 蛋白质数据库；相互作用研究技术 酵母双杂交技术 免疫共沉淀等,蛋白质分离技术双向凝胶电泳基本原理：第一向为等电聚焦(Isoelectro focusing, IEF)，根据蛋白的等电点不同进行分离；第二向为SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，按亚基分子量大小进行分离优点：较高的分辨率，可同时分离上万种蛋白质缺点：不适用于检测低丰度蛋白、疏水性及强酸强碱性蛋白；尚不能完全自动化，消耗时间长。,Spot Excision,双向电泳流程,

7、凝胶的图像处理分析和胶内酶切,凝胶图像的扫描：图像加工：斑点检测和定量：凝胶配比：数据分析：数据呈递和解释：2-DE数据库的建立：,图像扫描和分析Image Scanner II,全自动斑点切取系统（Ettan Spot Picker）,蛋白质鉴定技术Edman 降解优点：测定肽序列，非常准确缺点：成本高、测序速度较慢、灵敏度低，不适合鉴定数以百计的蛋白质 质谱法原理：通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子，然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值(M/Z 值)的蛋白质离子分离开来，经过离子检测器收集分离的离子，确定离子的M/Z 值，分析鉴定未知蛋白质。,质谱分析的特点,主要可以分

8、为三种方法,质谱分析方法,串联质谱序列分析,串联质谱（Tandem-MS）,第一级质谱得到肽的分子离子,选取目标肽的离子作为母离子，与惰性气体碰撞，使肽链中的肽键断裂，形成一系列离子，即N端碎片离子系列（B系列）和C端碎片离子系列（Y系列），将这些碎片离子系列综合分析，可得出肽段的氨基酸序列。“protein ladder sequencing”的方法，通过对Edman降解法的修改，产生一系列截去N端残基的肽段，用MALDI-MS测得这些肽段的质量，从而推测N端序列。,生物信息学技术,通过质谱所获得的鉴定结果通常都是高通量且比较复杂的，分析这些数据必须要通过自动化的方式对其进行识别、比较和分析

9、。 生物信息学（Bioinformatics）就是通过计算机以及信息理论对获得的蛋白质、核酸序列等大量的生物信息进行采集、处理、存储、分析及解释，并结合统计学、计算机和生物医学等来获得其具有的各种生物学功能的一门新兴的边缘学科。 借助生物信息学分析能够进一步了解和分析被测蛋白的种类、属性、结构、生物功能及其同源蛋白。,蛋白序列数据库SWISS-PROT/TrEMBL；http:/www.expasy.ch）基因序列数据库Genbank，http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/ EMBL， http:/www.ebi.ac.uk/）蛋白模式数据库Prosite；http:/www.

10、expasy.ch/sprot/prosite.html）蛋白质二维凝胶电泳数据库、蛋白三维结构数据库PDB，http:/www.pdb.bnl.gov/；FSSP，http:/www.embl-ebi.ac.uk）蛋白翻译后修饰数据库OGLYCBASE，http:/www.cbs.dtu.dk/databases/ OGLYCBASE）,蛋白质组学研究相关数据库,蛋白相互作用研究技术研究蛋白质间的相互作用的常用方法：酵母双杂交系统亲和层析免疫沉淀蛋白质交联 酵母双杂交系统是当前发展迅速、应用广泛的主要方法。,转录激活因子转录激活因子在结构上是组件式的(modular),即这些因子往往由两个或

11、两个以上相互独立的结构域构成,其中有DNA结合结构域(DNA binding domain,简称为DB)和转录激活结构域(activation domain,简称为AD),它们是转录激活因子发挥功能所必需的。单独的DB虽然能和启动子结合,但是不能激活转录。,酵母双杂交系统的建立与发展,报告基因,DB与AD分离，不转录,DB与AD结合，激活转录,双杂交的原理两个等测蛋白质1和2, 前者与酵母菌转录激活因子Gal4的DB结合, 另一个与Gal4的AD结合。,由DB和AD形成的融合蛋白现在一般分别称之为“诱饵”(bait)和“猎物”(fish)。,HIS基因表达,早期抑制糖分解及丙酮酸脱氢酶晚期影响脂代谢，促进炎症反应,小鼠出生第十天七个月后处死主要涉及通路：代谢、炎症反应和细胞骨架通路,蛋白质组学实验室所需的条件,Thank you！,