灵芝多糖的研究.doc

1、灵芝多糖的研究摘要:灵芝多糖是灵芝中的主要有效成分。本研究对灵芝多糖的分离和纯化方法作了阐述，对其化学结构作了初步分析，并且对工业发酵方法生产的三种灵芝菌粉与相应的野生或栽培的灵芝子实体进行了灵芝多糖含量方面的比较从而说明，利用现代发酵技术生产灵芝菌粉将很有希望成为以后生产灵芝的一种主要方法。 关键词：灵芝多糖;发酵灵芝菌粉;野生灵芝;栽培灵芝 中图分类号：S567.3+1 文献标识码： A 引言 灵芝的概述 灵芝隶属于真菌界，担子菌纲，无褶菌目，猴椅菌科，万年茸(灵芝)属。学名为 Ganoderma fucldlum(Fr.)Karst。它是观赏、医药兼用的菌类。由于整个菇体木化，可长久保存

2、不腐败，故有“万年菌“之称。 1.灵芝的保健作用 灵芝是我国传统的扶正固本，滋补强壮的中药，历代医书均将之列为中药上品。早在 2 千多年前的春秋战国时期列子，汤问列御寇中云“朽壤之一，有菌之者” ，并总结当时利于灵芝治病保健的经验：“煮百沸其味清芳，饮之明目，脑清，心静，肾坚，其宝物也” 。1最早的医学著作神农草经把灵芝列为上品，谓其“久味苦平，主治中结，益心气，补中，增智慧，不忘，久服轻身不老” 。李时珍的本草纲目中对灵芝药性和功效作了详尽的记述：赤芝，苦平无毒，主治中结，益心气，补中，增智慧，不忘；紫芝，甘温无毒，好颜色，治虚痨，治痔。2 现代药理和临床研究证明，灵芝中迄今已分离到 150

3、 余种化合物，但多数药理活性与灵芝多糖有关。活性多糖是一种具有某些特殊生理功能的多糖类高分子化合物，广泛存在于植物，动物和微生物组织中。近年来，多糖结构与功能的关系以及多糖复合物疫苗等研究在国际上受到了较多关注。灵芝多糖主要以下生理功能： （1）调节免疫功能 （2）抗肿瘤作用 （3）促进体内核酸与蛋白质的代谢 （4）抗氧自由基作用 （5）灵芝多糖有镇定作用，强心作用和提高实验动物耐受常压缺氧的能力等其他功能 2.实验的材料和方法 2.1 材料 泰山赤芝 T-1，韩国灵芝 K-1，日本灵芝 J-1.三种灵芝菌种均为山东莱芜农科所保存品种。 2.2 发酵培养基 采用当前灵芝发酵行业最常用的发酵培养

4、基配方之一：蔗糖4%，KH2PO4 0.15%，MgSO4*7H2O 0.075%， （NH4 ）2SO 4 0.05%，CaCO 3 0.1%， 消泡剂适量。 2.3 试剂 乙醇，葡萄糖，蒽酮，乙酸乙酯，浓硫酸等。 2.4 仪器 德国贝朗公司所生产的 Biostat-MD 型 10L 全自动发酵罐。722G 可见分光光度计及其它实验室常用小仪器。 2.5 实验方法 2.5.1 灵芝菌丝体的培养过程 将新培养的斜面母种转入种子培养基，28 度培养 7 天，镜检无杂菌后，按 5%的量接种到发酵罐内，发酵 56 天，发酵液残糖在 1%左右结束培养。 2.5.2 灵芝多糖的分离和纯化 2.5.2.1

5、 清液胞外多糖的提取 工艺流程：发酵液 离心发酵上清液 浓缩浓缩液透析透析液浓缩浓缩液 离心上清液乙醇沉淀 沉淀物干燥 胞外粗多糖 2.5.2.2 菌丝体胞内多糖的提取 工艺流程：工艺流程：发酵液 离心发酵上清液 浓缩浓缩液透析透析液浓缩浓缩液 离心上清液乙醇沉淀 沉淀物干燥 胞外粗多糖 2.5.2.3 粗多糖的纯化 工艺流程：粗多糖 脱蛋白 脱蛋白多糖 层析洗脱 含糖部分层析洗脱 多糖纯品 2.6 分析方法 2.6.1 多糖的纯度鉴定 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和凝胶过滤法进行检查纯度。 2.6.2 灵芝多糖含量的测定方法: 2.6.2.1 标准曲线的制备:准确配制 0.1000%葡萄糖储备液及

6、 0.2000蒽酮-已酸已脂显色剂。分别取 1.00, 2.00, 3.00, 4.00, 5.00ml 储备液，用水分别定容至 25ml 后，在分别取 0.50ml，加入干燥的 10ml 具塞试管中，在加入 4.00ml 浓硫酸，摇匀。5min 后加 1.00ml 显色剂，100水浴加热 10min，取出，冷却至室温后，以浓硫酸为空白对照，722G 可见分光光度计在 600nm 处，测吸光度值，计算其标准曲线回归方程。 2.6.2.2 换算因素的测定：纯灵芝多糖样品从日本获得。精确称取60.0mg，水溶解后定容至 100ml，取 4.00ml 水定容至 10ml。得多糖供试液，精确称取 0.

7、50ml，按（1）中方法显色，测定吸光度值，代入标准回归方程求出供试液的葡萄糖含量，以 f=W1/W2 计算因素 f(W1 为供试液中多糖实际重量，W2 为测定出的糖含量)。 2.6.2.3 样品溶液的制备：取待测样品适量，80%乙醇回流 4h，过滤，滤渣用水回流 2h。合并两次滤液，滤液冷却至室温后定容至 100ml，取30ml,用水定容至 10ml，得样品溶液。 2.6.2.4 多糖含量测定：取样品溶液 0.50ml，按 1 项方法显色，测定吸光度值，代入回归方程，求多糖含量：多糖cdf/w。c:样品浓度；d:样品稀释倍数；f:换算因素；w:样品重量。 2.6.3 发酵灵芝菌粉的获得分别以

8、三种灵芝菌种作为液体深层发酵的菌种，在 10L 全自动发酵罐中配好发酵培养基后，接种摇瓶种，然后按照灵芝发酵行业中常用的发酵参数进行发酵。等发酵结束后，收获菌丝。将菌丝烘干后粉碎，即得到发酵灵芝菌粉。 3.结果与讨论 3.1 发酵灵芝菌粉与野生或栽培灵芝子实体在灵芝多糖含量上的比较 将每种灵芝菌种连续 5 批发交所的到的灵芝发酵菌粉与野生或栽培灵芝的子实体同时取样，进行灵芝多糖含量的测定，结果如下表所示。 灵芝名称 栏目 数据 发酵菌粉 野生子实体 P 值 泰山赤芝 灵芝多糖含量(%) 6.72 4.64 P0.05 韩国灵芝 5.45 2.88 P0.05 日本灵芝 7.82 3.59 P0

9、.05 从上表可以看出，对于三种灵芝菌种的每一种而言，发酵灵芝菌粉在灵芝多糖含量上，均明显高于相应的野生或栽培灵芝子实体(p0.05)，甚至也明显高于另外两种子实体，说明通过发酵方法生产灵芝比栽培方法生产灵芝可显著提高多糖含量。其中尤其以日本灵芝 j1 在发酵时产生的多糖最多，说明该菌株最适于用作工业发酵菌株。 3.2 讨论 关于本研究，只是为了说明发酵方法生产的灵芝菌粉，其多糖含量完全比得上市面上出售的用于医疗和食品行业。而且本实验所采用的野生或栽培的灵芝子实体，均来自优良品种。除了泰山赤芝是国内的著名品种外，韩国和日本栽培灵芝也属于优质的推广使用的品种。因此从本实验的目的来说，我们的实验结果还是较有说服力的。因此本研究预言：应用现代发酵技术生产灵芝将成为今后灵芝生产的一种主要方法，从而使灵芝这一古老而珍贵的中药材能够更好的满足人们的需要并为人类的健康做出更大的贡献。 参考文献: 1陈体强，李开本，陈朝旭等，灵芝.紫芝担孢子及胞壁的超微结构J.福建农业学报，1998，13（4）：3338. 2李时珍，本草纲目M，北京：人民卫生出版社，1982，17111712