猪色素上皮衍生因子PEDF试剂盒ELISA.DOC

1、 Address: Kenneth G. Howell , 748 Nickel Road , San Francisco(415) , CA 94104 Telephone: 0014159141567 猪色素上皮衍生因子 （ PEDF） 试剂盒 （ ELISA） 使用说明书 本试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织、细胞上清及相关液体样本中 猪色素上皮衍生因子 （ PEDF） 的含量。 有效期： 6个月 保存条件： 2-8 本试剂盒仅供体外研究使用，不用于临床诊断 实验原理 试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ ELISA）。 往预先包 被 猪色素上皮衍生因子 （ PEDF） 捕获

2、 抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、 HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物 TMB显色， TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸 的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的 猪色素上皮衍生因子 （ PEDF） 呈 正相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度（ OD 值），计算样品浓度。 样本处理及要求 1. 血清 ：全血标本请于室温放置 2小时或 4 过夜后于 1000g离心 20分钟，取上清即可检测，或将标本放于 -20 或 -80 保存，但应避免反复冻融。 2. 血浆 ：可用 EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后 30分钟内于 2 - 8C 1000g离心

3、 20分钟，或将标本放于 -20 或 -80 保存，但应避免反复冻融。 3. 组织匀浆 ：用预冷的 PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的 PBS（一般按 1:9的重量体积比，比如 1g的组织样品对应 9mL的 PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在 PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于 5000 g离心 510分钟，取上清检测。 4. 细胞培养物上清或其它生物标本 ： 10

4、00g离心 20分钟，取上清即可 检测，或将标本放于 -20或 -80 保存，但应避免反复冻融。 注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。 Address: Kenneth G. Howell , 748 Nickel Road , San Francisco(415) , CA 94104 Telephone: 0014159141567 标本处理 1. 本公司只对试剂盒本身负责，不对因使用该试剂盒所造成的样本消耗负责，请使用者使用前充分考虑到样本的可能使用量，预留充足的样本。 2. 实验前应预测标本含量，如果标本浓度过高，应对标本进行稀释，使稀释后的标本符合试剂盒的检

5、测范围，计算时再乘以相应的稀释倍数。标本使用 0.01mol/L的 PBS稀释(PH=7.0-7.2)。 3. 若所检样本不包含在说明书所列样本之中 ，建议进行预实验验证其有效性，并注意留存样本。 4. 使用化学裂解液制备的组织匀浆或细胞提取液可能会由于某些化学物质的引入导致ELISA实验结果偏差。 5. 若样本为细胞培养上清，因该类样本干扰因素较多，如：细胞状态、细胞数量、采样时间等，所以可能存在检测不出的情况。 6. 某些天然蛋白或重组蛋白，包括原核及真核重组蛋白，可能因为与本产品所使用的检测抗体及捕获抗体不匹配，而不被检测出。 7. 建议使用新鲜样本，保存时间过长可能会存在蛋白降解或变性

6、导致实验结果偏差。 需要而未提供的试剂和器材 1. 酶标仪 （ 450nm） 2. 高精度加样器及枪头： 0.5-10uL、 2-20uL、 20-200uL、 200-1000uL 3. 37 恒温箱 4. 蒸馏水或去离子水 试剂盒组成 名称 96 孔配置 48 孔配置 备注 微孔酶标板 8 孔 12 条 8 孔 6 条 无 标准品 0.3mL*6 管 0.3mL*6 管 无 样本稀释液 6mL 3mL 无 检测抗体 -HRP 10mL 5mL 无 20洗涤缓冲液 25mL 15mL 按说明书进行稀释 底物 A 6mL 3mL 无 底物 B 6mL 3mL 无 终止液 6mL 3mL 无 封

7、 板膜 2 张 2 张 无 说明书 1 份 1 份 无 自封袋 1 个 1 个 无 备 注 ： 1. 标准品浓度依次为： 160、 80、 40、 20、 10、 0 ng/mL 2. 经过大量正常标本检验，标本的正常浓度值均在试剂盒提供的检测范围内，实验过程中直接取 50L样本上样即可。当有部分样本值超过最大标准品浓度时，可用样本稀释液将标本进行适当稀释后再进行实验。 Address: Kenneth G. Howell , 748 Nickel Road , San Francisco(415) , CA 94104 Telephone: 0014159141567 注意事项 1. 严格按

8、照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室温 20-25 。使用后立即冷藏保存试剂。 2. 洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中不要让微孔干燥掉。 3. 消除板底残留的液体和手指印，否则影响 OD 值。 4. 底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不能使用。 5. 避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。 6. 在储存和温育时避免强光直接照射。 7. 平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。 8. 任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。任何漂白成分都会破坏试剂盒中反应试剂的生物活性。 9.

9、 不能使用过期产品。 10. 如果可能传播疾病，所有的样品都应管理好，按照规定的程序处 理样品和检测装置 。 试剂准备 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡后方可使用。 20洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按 1： 20稀释，即 1份 20洗涤缓冲液加 19份蒸馏水。 操作步骤 1. 从室温平衡 20min 后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回 4 。 2. 设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品 50L； 3. 样本孔 中 加 入 待测样本 50L；空白孔不加。 4. 除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（ HRP）标记的检测抗体100L，用封板膜封住反应孔，

10、 37 水浴锅或恒温箱温育 60min。 5. 弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液 （ 350L） ，静置 1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板 5 次（也可用洗板机洗板）。 6. 每孔加入底物 A、 B 各 50L， 37 避光孵育 15min。 7. 每孔加入终止液 50L， 15min 内，在 450nm 波长处测定各孔的 OD 值。 实验结果计算 以 所测标准品的 OD值 为横坐标， 标准品的浓度 值为纵坐标，在坐标纸上 或用相关软件绘制 标准曲线 ，并得到 直线回归方程 ， 将样品的 OD值代入方程，计算出样品 的 浓度 。 试剂盒性能 1. 检测范围 ： 5 ng/

11、mL 160 ng/mL。 2. 灵敏度：最低检测浓度小于 1.0 ng/mL。 3. 特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。 4. 重复性：板内变异系数小于 10% ， 板间变异系数小于 15% 。 Address: Kenneth G. Howell , 748 Nickel Road , San Francisco(415) , CA 94104 Telephone: 0014159141567 说明 1. 由于现有条件及科学技术水平尚不能对所有供货商提供的所有原料进行全面的鉴定与分析，本产品可能存在一定的质量技术风险。 2. 最终的实验结果与试剂的有效性、实验者的相关操作以及当时的

12、实验环境密切相关，请务必准备充足的标本备份。 3. 不同批次的同一产品可能会有少许差别，如：检测限、灵敏度以及显色时间等，请依据试剂盒内说 明书进行实验操作，网站电子版说明书仅作参考。 4. 只有全部使用本试剂盒配套试剂才能保证检测效果，不能混用其他制造商的产品。只有严格遵守本试剂盒的实验说明才会得到最佳的检测结果。 问题解答 若实验效果不好，请及时对显色结果拍照，保留所用板条及未使用试剂，并妥善保存，然后联系我公司技术支持为您解决问题。同时您也可以参考以下资料： 问题 可能原因 解决方案 标准曲线差 吸取及洗涤不充分 充分的吸取及洗涤 移液不精确 检查和校正移液器 精密度低 洗涤不充分 按说

13、明书要求充分洗涤和浸泡 混匀不充分和 吸取试剂不足 充分混匀和吸取试剂 重复利用吸头、容器和覆膜 使用加样器要更换新的吸头、使用新的容器和覆膜 加样不精确 检查和校正移液器 O.D 值低 每孔加的试剂量不精确 校正移液器，精确加入试剂 温育时间不正确 保证充足的温育时间 温育温度不正确 试剂要平衡至室温并保证准确的温育温度 酶标记物或底物失效 通过混合酶标记物和底物，颜色应迅速显现来检查 没有加入终止液 按照说明书实验操作步骤加入终止液 超出读数时间读数 在说明书推荐的读数时间内读数 样本值 不正确的样本储存方式 正确储存样本，使用新鲜样本进行实验 不正确的样本收集和处理方法 采取正确的样本收集和处理方法 待测物质在样本中含量低 使用新鲜样本，重复实验