十炭疽防治技术规范.DOC

1、 254 十三、炭疽防治技术规范 炭疽（ Anthrax）是由炭疽芽胞杆菌引起的一种人畜共患传染病。世界动物卫生组织 （ OIE）将其列为必须报告的动物疫病，我国将其列为二类动物疫病。 为预防和控制炭疽，依据中华人民共和国动物防疫法和其它相关法律法规，制定本规范。 1 适用范围 本规范规定了炭疽的诊断、疫情报告、疫情处理、防治措施和控制标准。 本规范适用于中华人民共和国境内一切从事动物饲养、经营及其产品的生产、经营的单位和个人，以及从事动物防疫活动的单位和个人。 2 诊断 依据本病流行病学调查、临床症状，结合实 验室诊断结果做出综合判定。 2.1 流行特点 本病为人畜共患传染病，各种家畜、野生

2、动物及人对本病都有不同程度的易感性。草食动物最易感，其次是杂食动物，再次是肉食动物，家禽一般不感染。人也易感。 患病动物和因炭疽而死亡的动物尸体以及污染的土壤、草地、水、饲料都是本病的主要传染源，炭疽芽胞对环境具有很强的抵抗力，其污染的土壤、水源及场地可形成持久的疫源地。本病主要经消化道、呼吸道和皮肤感染。 本病呈地方性流行。有一定的季节性，多发生在吸血昆虫多、雨255 水多、洪水泛滥的季节。 2.2 临床症状 2.2.1 本规 范规定本病的潜伏期为 20 天。 2.2.2 典型症状 本病主要呈急性经过，多以突然死亡、天然孔出血、尸僵不全为特征。 牛：体温升高常达 41以上，可视黏膜呈暗紫色，

3、心动过速、呼吸困难。呈慢性经过的病牛，在颈、胸前、肩胛、腹下或外阴部常见水肿；皮肤病灶温度增高，坚硬，有压痛，也可发生坏死，有时形成溃疡；颈部水肿常与咽炎和喉头水肿相伴发生，致使呼吸困难加重。急性病例一般经 24 36 小时后死亡，亚急性病例一般经 2 5 天后死亡。 马：体温升高，腹下、乳房、肩及咽喉部常见水肿。舌炭疽多见呼吸困难、发绀；肠炭疽腹痛明 显。急性病例一般经 24 36 小时后死亡，有炭疽痈时，病程可达 3 8 天。 羊：多表现为最急性（猝死）病症，摇摆、磨牙、抽搐，挣扎、突然倒毙，有的可见从天然孔流出带气泡的黑红色血液。病程稍长者也只持续数小时后死亡。 猪：多为局限性变化，呈慢

4、性经过，临床症状不明显，常在宰后见病变。 犬和其它肉食动物临床症状不明显。 2.3 病理变化 死亡患病动物可视黏膜发绀、出血。血液呈暗紫红色，凝固不良，粘稠似煤焦油状。皮下、肌间、咽喉等部位有浆液性渗出及出血。淋巴结肿大、充血，切面潮红。脾脏高度肿胀，达正常数倍，脾髓呈黑256 紫 色。 严禁在非生物安全条件下进行疑似患病动物、患病动物的尸体剖检。 2.4 实验室诊断 实验室病原学诊断必须在相应级别的生物安全实验室进行。 2.4.1 病原鉴定 2.4.1.1 样品采集、包装与运输 按照 NY T561 2.1.2、 4.1、 5.1 执行。 2.4.1.2 病原学诊断 炭疽的病原分离及鉴定（见

5、 NY/T561）。 2.4.2 血清学诊断 炭疽沉淀反应（见 NY/T561）。 2.4.3 分子生物学诊断 聚合酶链式反应（ PCR）（见附件 1）。 3 疫情报告 3.1 任何单位和个 人发现患有本病或者疑似本病的动物，都应立即向当地动物防疫监督机构报告。 3.2 当地动物防疫监督机构接到疫情报告后，按国家动物疫情报告管理的有关规定执行。 4 疫情处理 依据本病流行病学调查、临床症状，结合实验室诊断做出的综合判定结果可做为疫情处理依据。 4.1 当地动物防疫监督机构接到疑似炭疽疫情报告后，应及时派员到现场进行流行病学调查和临床检查，采集病料送符合规定的实验室诊断，并立即隔离疑似患病动物及

6、同群动物，限制移动。 257 对病死动物尸体，严禁进行开放式解剖检查，采样时必须按规定进行，防止病原污染环 境，形成永久性疫源地。 4.2 确诊为炭疽后，必须按下列要求处理。 4.2.1 由所在地县级以上兽医主管部门划定疫点、疫区、受威胁区。 疫 点：指患病动物所在地点。一般是指患病动物及同群动物所在畜场（户组）或其它有关屠宰、经营单位。 疫 区：指由疫点边缘外延 3 公里范围内的区域。在实际划分疫区时，应考虑当地饲养环境和自然屏障（如河流、山脉等）以及气象因素，科学确定疫区范围。 受威胁区：指疫区外延 5 公里范围内的区域。 4.2.2 本病呈零星散发时，应对患病动物作无血扑杀处理，对同群动

7、物立即进行强制免疫接种，并 隔离观察 20 天。对病死动物及排泄物、可能被污染饲料、污水等按附件 2 的要求进行无害化处理；对可能被污染的物品、交通工具、用具、动物舍进行严格彻底消毒（见附件 2）。疫区、受威胁区所有易感动物进行紧急免疫接种。对病死动物尸体严禁进行开放式解剖检查，采样必须按规定进行，防止病原污染环境，形成永久性疫源地。 4.2.3 本病呈暴发流行时（ 1 个县 10 天内发现 5 头以上的患病动物），要报请同级人民政府对疫区实行封锁；人民政府在接到封锁报告后，应立即发布封锁令，并对疫区实施封锁。 疫点、疫区和受威胁区采取的处理措施如下： 4.2.3.1 疫点 出入口必须设立消毒

8、设施。限制人、易感动物、车辆进出和动物产品及可能受污染的物品运出。对疫点内动物舍、场地以及所有运载258 工具、饮水用具等必须进行严格彻底地消毒。 患病动物和同群动物全部进行无血扑杀处理。其它易感动物紧急免疫接种。 对所有病死动物、被扑杀动物，以及排泄物和可能被污染的垫料、饲料等物品产品按附件 2 要求进行无害化处理。 动物尸体需要运送时，应使用防漏容器，须有明显标志，并在动物防疫监督机构的监督下实施。 4.2.3.2 疫区：交通要道建立动物防疫监督检查站，派专人监管动物及 其产品的流动，对进出人员、车辆须进行消毒。停止疫区内动物及其产品的交易、移动。所有易感动物必须圈养，或在指定地点放养；对

9、动物舍、道路等可能污染的场所进行消毒。 对疫区内的所有易感动物进行紧急免疫接种。 4.2.3.3 受威胁区：对受威胁区内的所有易感动物进行紧急免疫接种。 4.2.3.4 进行疫源分析与流行病学调查 4.2.3.5 封锁令的解除 最后 1 头患病动物死亡或患病动物和同群动物扑杀处理后 20 天内不再出现新的病例，进行终末消毒后，经动物防疫监督机构审验合格后，由当地兽医主管部门向原发布封锁令的机 关申请发布解除封锁令。 4.2.4 处理记录 对处理疫情的全过程必须做好完整的详细记录，建立档案。 5 预防与控制 5.1 环境控制 饲养、生产、经营场所和屠宰场必须符合 动物防疫条件审核管259 理办法

10、（农业部 200215 号令）规定的动物防疫条件， 建立严格的卫生（消毒）管理制度。 5.2 免疫接种 5.2.1 各省根据当地疫情流行情况，按农业部制定的免疫方案，确定免疫接种对象、范围。 5.2.2 使用国家批准的炭疽疫苗，并按免疫程序进行适时免疫接种，建立免疫档案。 5.3 检疫 5.3.1 产地检疫 按 GB16549 和 动物检疫管理办法 实施检疫。检出炭疽阳性动物时，按本规范 4.2.2 规定处理。 5.3.2 屠宰检疫 按 NY467 和 动物检疫管理办法 对屠宰的动物实施检疫。 5.4 消毒 对新老疫区进行 经常性消毒 ，雨季要重点消毒。皮张、毛等按照附件 2 实施消毒。 5.

11、5 人员 防护 动物防疫检疫、实验室诊断及 饲养场 、畜产品及皮张加工企业 工作人员 要注意个人防护， 参与疫情处理的有关人员，应穿防护服、戴口罩和手套，做好自身防护。 260 附件 1 聚合酶链 式 反应（ PCR）技术 1 试剂 1.1 消化液 1.1.1 1M 三羟甲基氨基甲烷 -盐酸 (Tris-HCl)(pH8.0) 三羟甲基氨基甲烷 12.11g 灭菌双蒸水 80mL 浓盐酸 调 pH至 8.0 灭菌双蒸水 加至 100mL 1.1.2 0.5M 乙二铵四乙酸二钠 (EDTA)溶液 (pH8.0) 二水乙二铵四乙酸二钠 18.61g 灭菌双蒸水 80mL 氢氧化钠 调 pH至 8.

12、0 灭菌双蒸水 加至 100mL 1.1.3 20% 十二烷基磺酸钠 (SDS)溶液 (pH7.2) 十二烷基磺酸钠 20g 灭菌双蒸水 80mL 浓盐酸 调 pH至 7.2 灭菌双蒸水 加至 100mL 1.1.4 消化液配制 1M 三羟甲基氨基甲烷 -盐酸 (Tris-HCl)(pH8.0) 2mL 0.5mol/L 乙二铵四乙酸二钠溶液 (pH8.0) 0.4mL 20% 十二烷基磺酸钠溶液 (pH7.2) 5mL 261 5M 氯化钠 4mL 灭菌双蒸水 加至 200mL 1.2 蛋白酶 K 溶液 蛋白酶 K 5g 灭菌双蒸水 加至 250mL 1.3 酚 /氯仿 /异戊 醇混合液 碱

13、性酚 25mL 氯仿 24mL 异戊醇 1mL 1.4 2.5mmol/LdNTP dATP(100mmol/L) 20L dTTP(100mmol/L) 20L dGTP(100mmol/L) 20L dCTP(100mmol/L) 20L 灭菌双蒸水 加至 800L 1.5 8pmol/L PCR 引物 上游引物 ATXU（ 2 OD） 加入 701l 灭菌双蒸水溶解 ， 下游引物ATXD（ 2 OD） 加入 697L 灭菌双蒸水溶解 ， 分别取 ATXU、 ATXD 溶液各 300L， 混匀即为 8pmol/L 扩增引物。 1.6 0.5 单位 Taq DNA 聚合酶 5 单位 Taq

14、DNA 聚合酶 1L 灭菌双蒸水 加至 10L 现用现配。 1.7 10 PCR 缓冲液 1.7.1 1mol/L 三羟甲基氨基甲烷 -盐酸 (Tris-HCl)( pH9.0) 262 三羟基甲基氨基甲烷 15.8g 灭菌双蒸水 80mL 浓盐酸 调 pH至 9.0 灭菌双蒸水 加至 100mL 1.7.2 10 倍 PCR 缓冲液 1mol/L三羟基甲基氨基甲烷 -盐酸 (Tris-HCl)( pH9.0) 1mL 氯化钾 0.373g 曲拉通 X-100 0.1mL 灭菌双蒸水 加至 100mL 1.8 溴化乙锭 (EB)溶液 溴化乙锭 0.2g 灭菌双蒸水 加至 20mL 1.9 电泳

15、缓冲液 (50 倍 ) 1.9.1 0.5mol/L 乙二铵四乙酸二钠 (EDTA)溶液 (pH8.0) 二水乙二铵四乙酸二钠 18.61g 灭菌双蒸水 80mL 氢氧化钠 调 pH至 8.0 灭菌双蒸水 加至 100mL 1.9.2 TAE 电泳缓冲液 (50 倍 ) 三羟基甲基氨基甲烷 (Tris) 242g 冰乙酸 57.1mlL 0.5mol/L 乙二铵四乙酸二钠溶液 (pH8.0) 100mL 灭菌双蒸水 加至 1 000mL 用时用灭菌双蒸水稀释使用 1.10 1.5琼脂糖凝胶 263 琼脂糖 3g TAE 电泳缓冲液 (50 倍 ) 4mL 灭菌双蒸水 196mL 微波炉中完全融

16、化，加溴化乙锭（ EB）溶液 20L。 1.11 上样缓冲液 溴酚蓝 0.2g，加双蒸水 10mL 过夜溶解。 50g 蔗糖加入 50ml 水溶解后，移入已溶解的溴酚蓝溶液中，摇匀定容至 100mL。 1.12 其它试剂 异丙醇 (分析纯 ) 70%乙醇 15mmoL/L 氯化镁 灭菌双蒸水 2 器材 2.1 仪器 分析天平、高速离心机、真空干燥器、 PCR 扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪（或紫外分析仪）、液氮或 -70冰箱、微波炉、组织研磨器、 -20冰箱、可调移液 器（ 2L 、 20L、 200L、 1000L）。 2.2 耗材 眼科剪、眼科镊、称量纸、 20 mL 一次性注射器、 1.5 mL 灭菌离心管、 0.2 mL 薄壁 PCR 管、琼脂糖、 500 mL 量筒、 500 mL 锥形瓶、吸头 (10L、 200L、 1000L)、灭菌双蒸水。 2.3 引物设计 根据 GenBank 上已发表的炭疽杆菌 POX1 质粒序列，设计并合成了以下两条引物： ATXU： 5-AGAATGTATCACCAGAGGC-3 ATXD： 5-GTTGTAGATTGGAGC