精子形态学分析的标准化2016.ppt

1、精子形态学分析的标准化,生殖健康,一、精子的基本形态,精子主要由三部分组成 头部 颈部和中段 尾部,1. 精子的正常形态,头部：扁椭圆形，长45m、宽 2.53.5m、厚约1.0m。 中段：细，宽度1m，大约为头部 长度的1.5倍；胞浆小滴正常 头部大小的1/2。 尾部：长约45m，比中段细，均 一、非卷曲。,精子头部超微结构,1.核 2.顶体 3.细胞膜 4.核囊 5.核膜孔 6.颈部 7.基底板 8.横纹小柱 9.中心子（近端） 10.中心子（远端） 11.外纤维 12.鞭毛轴丝 13.线粒体,精子超微结构,A 精子的整体形态：1.头部顶体， 2.颈部，3.中部，4.尾部B 中部与尾部的联

2、结部位：5.中部断 面线粒体，6.纤维鞘，7.九根外纤 维，8.九根周围小管，9.组中心小 管，10.细胞膜C B的断面：11.纵向支柱D 尾部近远端E 终端主节与终节相连部F 终节：12.微细管,精子颈部和中段超微结构,B 颈部（局部）： 1.线粒体，2.外纤维，3.细胞膜 4.中心子（近位） 5.中心子（远位），6.外纤维 7.横纹小柱，8.关节样小头 9.关节样小头顶，10.轴丝C 中部断面： 1.线粒体 2.外纤维,2.异常精子形态,头部缺陷 锥形、梨形、圆形 无定形、头部有空泡 小顶体,头部缺陷的异常精子,顶体过小,顶体过大,头部一侧呈椭圆形的弧形,颈部和中段缺陷 颈部弯曲 中段非对

3、称性插入 中段过粗 中段过细 胞浆小滴,2.异常精子形态,颈部过粗,颈部和中段缺陷的异常精子,中段和头部 分离,尾部连接处 扁平,尾部缺陷 短尾 折尾 尾部弯曲,2.异常精子形态,二、精子形态与功能,1. 头部主要的结构: 细胞核和顶体 细胞核: 父方的遗传物质、单倍体，双链 DNA，与鱼精蛋白紧密结合。 顶体:覆盖精子核前2/3的扁囊状结构 含有多种与卵子的识别和受精相关 的酶 其中最重要的是顶体蛋白酶和透明 质酸酶,2. 颈部和中段 连接头部和尾部 中段的线粒体鞘含有大量的线粒体 为精子的运动提供能量 9+2结构,二、精子形态与功能,3. 尾部 运动,二、精子形态与功能,三、精子形态分析常

4、用方法,用于精子形态学分析的染色方法有： 改良巴氏染色法、苏木精-伊红（HE）染色法、 瑞氏染色法、瑞-吉氏染色法、Diff-Quik染色法和 Shorr染色法。 6种染色方法对精子头大小的影响不同，瑞-吉氏和瑞 氏染色法的精子头的长轴和短轴最高，其次为Diff- Quik染色法，巴氏染色法的精子头的长轴和短轴最 低，而HE和Shorr染色法的精子头长轴和短轴介于巴 氏染色法和Diff-Quik染色法之间。,6种精子染色方法的染色效果亦不同: Diff-Quik和Shorr染色法可以很清楚地区分顶体和核 其次为HE染色法， 而巴氏、瑞氏和瑞-吉氏染色的精子顶体和核分界不 很明显。 基于不同染色

5、方法对精子头大小的影响、染色效果以 及操作的简易与否，推荐Diff-Quik和Shorr染色法。,三、精子形态分析常用方法,精子形态分析的标准有： WHO标准 严格标准；分析方法： 人工法 计算机自动分析,三、精子形态分析常用方法,1 涂片的制备 一般用新鲜的液化精液或生理盐水洗涤过的精子悬液进行涂片， 通常每份标本涂双份片子，以备染色或操作出问题。载玻片应洁 净，可用70%酒精洗涤并干燥后使用；涂片的厚薄应根据精子密 度而定，精子密度高者涂片应薄些，而精子密度低者涂片应尽可 能厚些。 方法 涂片的方法有多种，WHO推荐的方法有拉薄技术和滴管法，拉 薄技术即用另一张载玻片的边缘拖拉载玻片上的一

6、滴精液；滴管 法即水平持滴管使一滴精液沿载玻片的表面展开。由于精液有一 定粘稠度，这两种方法都很难涂成均匀的涂片，可作为可选择性 方法使用。,三、精子形态分析常用方法,推荐涂片方法 推荐精子涂片方法 (改良滴管法)：用滴管将一滴精液置于载玻 片上，然后从液滴中央向周围循环吸净多余的精液，注意滴管 的头要平整，滴管与载玻片垂直，缓慢吸去多余的液体。 低密度、粘稠的、或充满碎屑的标本，建议先离心去除精浆， 沉淀的精子团重新悬浮在适当体积中，以获得尽可能高的密 度，但不应超过80106/ml。正常精子密度且液化良好的精液 标本亦可以洗涤后用精子悬液进行涂片，但离心操作对精子形 态分析有无影响，尚需要

7、进一步验证。 精子涂片可进行空气干燥并固定。固定程序取决于染色方法。,三、精子形态分析常用方法,2Shorr染色法（WHO推荐） 精子涂片空气干燥后，用苏木精染色12分钟；流水浸洗后置 42温水中蓝化5分钟（或浸入乙醇铵中蓝化）；Shorr染剂 （BDH Shorr粉4 g溶于220 ml 50%温乙醇中，冷却，加入2.0 ml 冰醋酸，过滤即可）染35分钟；流水冲洗，晾干后镜检。 3Diff-Quik染色法（WHO、SCA分析系统推荐） 精子涂片先置于固定液（1.8 mg二芳基甲烷加至1 L甲醇中而 成）中固定15秒；将玻片直立于吸水纸上以去除多余的液体；将 玻片在溶液1（1 g氧甲蒽加至1

8、 L叠氮钠防腐液中）中染色10秒 钟，然后在溶液2（0.625 g天蓝A和0.625 g亚甲基蓝加至1 L缓冲 液中）中染色5秒钟，各步骤之间均除去多余的液体；在流水中 浸洗1015次以除去多余的染料；将玻片垂直竖立以去除水分， 使之完全干燥；油镜下观察。,三、精子形态分析常用方法,4改良巴氏染色(WHO推荐) (1) EA-50的配制 将伊红Y、俾士麦棕、亮绿SF染剂分别配成 100g/L的水溶液，作储备液；将上列储备液伊红Y 5ml，俾士 麦棕1ml，亮绿1.25ml混匀，用95%乙醇加至200ml。然后加 入0.4g磷钨酸和0.1ml饱和碳酸锂溶液，混匀后放入棕黑色瓶 中，于室温可保存3

9、个月左右。使用前必须过滤。 (2) 橙黄G6的配制 称橙黄G6 0.5g，溶于5ml蒸馏水，待溶解后加 95%乙醇至100ml，然后加磷钨酸15mg，混匀后置棕黑色瓶 中，用前必须过滤。室温下此液可保存3个月。,三、精子形态分析常用方法,4改良巴氏染色(WHO推荐) (3) 哈里斯(Harris)苏木精的配制 称硫酸铝铵20g，溶于200ml蒸 馏水；称苏木精1g，溶于10ml 95%乙醇中。将苏木精溶液加 入硫酸铝铵溶液中，混匀并加热至95。然后慢慢加入氧化 汞0.8g。搅拌使其溶解，此时溶液呈深紫色。冷却后过滤，使 用前以等量蒸馏水稀释，并再一次过滤。 (4) 酸性乙醇溶液的配制 无水乙醇

10、30ml，加浓盐酸0.2m和蒸馏水 10ml混匀。 (5) 固定液的配制 无水乙醇：乙醚为1:1。,三、精子形态分析常用方法,4改良巴氏染色(WHO推荐) (6)操作方法 将洗涤后的精子悬液涂片，在空气中自然干燥，然 后用固定液固定610分钟 将已固定的涂片依次浸入80%， 70%，50%乙醇内30秒，最后置于蒸馏水中1分钟；在苏木素 染液中染10分钟，取出流水洗5分钟，然后浸入酸性乙醇1分 钟，流水洗510分钟；涂片依次浸入50%，70%，80%， 95%乙醇内各30秒在橙黄G6染液中染35分钟，在95%乙 醇中浸洗1分钟；在EA-50染液中染1520分钟，于95%乙醇 中浸洗30秒，再依次

11、浸入3缸二甲苯中使其透明，每缸约12分 钟用光学树脂加盖片封固，油镜下观察。,三、精子形态分析常用方法,5苏木紫伊红染色法(HE) (1) 苏木紫染液的配制 实验室常用的是哈里斯(Harris)苏木紫 液。甲液：苏木紫1g，无水乙醇10ml；乙液：硫酸铝钾 20g，蒸馏水20ml，加温溶解。甲、乙两液分别溶解后混 合，加热煮沸，沸后去火，待溶液不翻腾时立即加入氧化 汞0.5g(此时有大量气泡生成，故容器宜大，以免液体溢 出)。然后使染液迅速冷却，冷却后过滤即可应用。用时 每10ml加冰醋酸4ml。 (2) 伊红Y液配制 伊红Y 1g，蒸馏水5ml，溶解后将冰醋酸滴于 其中，有沉淀生成，至成浆糊

12、状再加水数毫升，并继续滴冰 醋酸，直至沉淀不再增加，过滤，弃滤液留沉淀物，特其干 燥后，溶于95%乙醇200ml中即成。,三、精子形态分析常用方法,5苏木紫伊红染色法(HE) (3)固定液配制9乙醇：乙醚为1:1。 (4)操作方法 涂片置固定液中固定15分钟；已固定的涂片流 水洗2分钟，蒸馏水洗1分钟；苏木紫液染色约5分钟(视着色 情况增减)；水洗，1%盐酸分色，显微镜下控制；流水浸 洗至少15分钟，至细胞核呈蓝色；也可短时水洗后，浸于40 温水使核变蓝。在显微镜下观察，若核染色过深或不足，应再 次分色或重染；伊红Y液染12分钟后，95%乙醇浸洗2次， 无水乙醇浸洗2次，每次约12分钟 ；苯酚

13、 :二甲苯(1:3) 浸 洗5分钟； 二甲苯2次，每次浸洗35分钟；用中性树胶封 片，显微镜下观察。,三、精子形态分析常用方法,6瑞-姬氏混合染色法 (1) 瑞氏染液 称取瑞氏染料0.1g，放在清洁干燥乳钵里，加少 量甲醇，边加边磨使染料溶解。将已溶解的染料倒入棕色瓶 中，加甲醇至60ml，置室温下1周即可使用。 (2) 姬姆萨染液 称取姬母萨染料0.5g，置于33ml甘油中，60 水浴2h，使其溶解，再加入60预热的甲醇33ml，混合后 置棕色瓶内，室温下放置数日后方能使用。 (3) 操作方法: 取液化的精液离心(000r/min)10分钟，弃上清 液，留取沉淀再加生理盐水，相同上述操作，洗

14、涤3次，配 制成10106/ml浓度的精子悬液，涂片自然干燥。用瑞-姬 氏混合液(10:1)染3060秒，加等量pH6.9磷酸盐缓冲液， 染色10分钟，自来水冲洗，待自然干燥后，用光学树脂封 片，置油镜下镜检。,三、精子形态分析常用方法,四、精子形态分析与临床,精子形态是迄今为止和受精率最相关的 指标，并且操作简单，费用少。不少研 究机构的研究结果表明，采用严格精子 形态分析能较好地预测受精结果。一般 将正常形态精子的正常值定为15%，正 常形态精子15%的精子，体外受精率 在80%以上；而正常精子低于5%的， 其IVF受精率30%。,精索静脉曲张患者头部缺陷、含胞浆小 滴精子的比例比正常者显

15、著升高，并随 精索静脉曲张程度的增加而升高。 少、弱精子症患者精子形态异常的比例 显著增加，异常精子中以头部缺陷为 主。,四、精子形态分析与临床,解脲支原体等感染的精液，异常精子率 显著增加。,四、精子形态分析与临床,长期接触农药或服用绵籽油，可引起以 小头精子、颈部缺陷精子为主的异常形 态精子的比例升高。,四、精子形态分析与临床,吸烟和大量饮酒是产生异常形态精子 增加的重要因素，异常精子以头部异常 为主。,四、精子形态分析与临床,雷达辐射可造成双头精子、大头精子、 无定形精子、颈部和中段异常精子显著 升高。,四、精子形态分析与临床,在去除感染、辐射、农药中毒、不良生 活习惯（吸烟等）的因素后

16、，正常形态 精子的比例迅速增加。精子形态分析是 提供男性不育症预后的重要指标。,四、精子形态分析与临床,一些中药、微量元素（锌等）、抗氧化 剂等能有效提高正常精子的比例。,四、精子形态分析与临床,现有资料表明：精子形态是与男性 生殖能力最相关的精液参数之一。 精子形态分析方法简单、实用性 强，临床医生应高度重视。 精子形态分析的标准化亟待完善和 推广。,四、精子形态分析与临床,九十年代实验室检查精液大多采用人工方法,但较八十年代比较,由于不少单位使用了MACRO精子计数板而提高了准确性。近十年来电脑技术的运用使精子速疫和轨迹成为精液分析的重要参数。精子形态检查成为重要的男性不育症的分析指标,仪器设备的更新势在必行,谁先更新谁的诊疗技术先提高,科研成果更有价值。抢占市场先机更能吸引更多的病人,创造更好的经济效益。,Thank You!,