人脂联素ADP酶联免疫分析ELISA.DOC

1、 1 人脂联素 (ADP)酶联免疫分析 (ELISA) 试剂盒使用说明书 本试剂仅供研究使用 人 血清，血浆及相关液体样本中 脂联素 (ADP)的 含量。 试剂盒性能： 1.样品线性回归与预期浓度相关系数 R 值为 0.95 以上。 2.批内与批见应分别小于 9%和 11% 检测范围： 请来电咨询 保存条件及有效期： 1.试剂盒保存： ； 2-8 。 2有效期： 6 个月 注意事项： 1 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡 15-30 分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。 2 浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时 可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。 3 各步加样均

2、应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在 5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。 4 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高 (样本 OD 值大于标准品孔第一孔的 OD 值 )，请先用样品稀释液稀释一定倍数 (n倍 )后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数 ( n 5)。 5 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。 6 底物请避光保存。 7 严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数 为准 . 8 所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。 9 本试剂不同批号组分不得混用。 10. 如与英文说明书有异，以英文说明书为

3、准。 实验原理： 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中 人脂联素 (ADP)水平。用纯化的 人脂联素 (ADP)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入 脂联素 (ADP)，再与 HRP 标记的 脂联素 (ADP)抗体结合，形成抗体 -抗原 -酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物 TMB 显色。 TMB 在 HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中 的 脂联素 (ADP)呈正相关。用酶标仪在 450nm波长下测定吸光度 (OD 值 )，通过标准曲线计算样品中 人脂联素 (ADP)浓度。 样本处理及要求 ： 1. 血清：室温血液自然凝固 10

4、-20 分钟，离心 20 分钟左右 (2000-3000 转 /分 )。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。 2 2. 血浆：应根据标本的要求选择 EDTA 或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合 10-20 分钟后，离心 20 分钟左右 (2000-3000 转 /分 )。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。 3. 尿液：用无菌管收集，离心 20 分钟左右 (2000-3000 转 /分 )。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。 4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心 20 分钟左右(2000-3000 转 /分 )。

5、仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用 PBS(PH7.2-7.4)稀释细胞悬液，细胞浓度达到 100 万 /ml 左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心 20 分钟左右 (2000-3000 转 /分 )。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。 5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的 PBS， PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持 2-8的温度。加入一定量的 PBS(PH7.4)，用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心 20 分钟左右 (2000-3000 转 /分 )。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。 6. 标本采集后尽早进

6、行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可 将标本放于 -20保存，但 应避免反复冻融 . 7. 不能检测含 NaN3 的样品 ，因 NaN3 抑制辣根过氧化物酶的 (HRP)活性。 试剂盒组成 ： 试剂盒组成 48 孔配置 96 孔配置 保存 说明书 1 份 1 份 封板膜 2 片 (48) 2 片 (96) 密封袋 1 个 1 个 酶标包被板 1 48 1 96 2-8保存 标准品： 2700ng/L 0.5ml 1 瓶 0.5ml 1 瓶 2-8保存 标准品稀释液 1.5ml 1 瓶 1.5ml 1 瓶 2-8保存 酶标试剂 3 ml 1 瓶 6 ml 1

7、瓶 2-8保存 样品稀释液 3 ml 1 瓶 6 ml 1 瓶 2-8保存 显色剂 A 液 3 ml 1 瓶 6 ml 1 瓶 2-8保存 显色剂 B 液 3 ml 1 瓶 6 ml 1 瓶 2-8保存 终止液 3ml 1 瓶 6ml 1 瓶 2-8保存 浓缩洗涤液 (20ml 20 倍 ) 1 瓶 (20ml 30 倍 ) 1 瓶 2-8保存 操作步骤 1. 标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔 10 孔，在第一、第二孔中分别加标准品 100l，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液 50l，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取 100l分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀

8、释液 50l，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取 50l弃掉，再各取 50l分别加到第五、第六孔中，再在第五、 第六孔中分别加标准品稀释液 50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取 50l分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液 50l，混匀后从第七、第八孔中分别取 50l加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液 50l，混匀后从第九第十孔中各取 50l弃掉。 (稀释后各孔加3 样量都为 50l，浓度分别为 1800ng/L， 1200ng/L ， 600ng/L， 300ng/L， 150ng/L)。 2. 加样：分别设空白孔 (空白对照孔不加样品及酶标试剂

9、，其余各步操作相同 )、待测 样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液 40l，然后再加待测样品 10l(样品最终稀释度为 5 倍 )。 加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3. 温育：用封板膜封板后置 37温育 30 分钟。 4. 配液：将 30(48T 的 20 倍 )倍浓缩洗涤液用蒸馏水 30(48T 的 20 倍 )倍稀释后备用。 5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此重复 5 次，拍干。 6. 加酶：每孔加入酶标试剂 50l，空白孔除外。 7. 温育：操作同 3。 8. 洗涤：操作同 5。 9. 显色：每孔先加入显色剂 A50l，再加入显色剂 B50l，轻轻震荡混匀， 37避光显色 15 分钟 . 10. 终止：每孔加终止液 50l，终止反应 (此时蓝色立转黄色 )。 11. 测定：以空白空调零， 450nm 波长依序测量各孔的吸光度 (OD 值 )。 测定应在加终止液后 15 分钟以内进行。 计算： 以标准物的浓度为横坐标， OD 值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的 OD 值由标准曲 线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与 OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的 OD 值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。