芳香族氨基酸发酵.ppt

1、芳香族氨基酸发酵的生物合成途径及代谢调节机制，以及生产,目录,一、芳香族氨基酸性质简介,二、芳香族氨基酸的生物合成途径,三、芳香族氨基酸的代谢调控机制,四、色氨酸发酵机制,五、色氨酸的生产,六、苯丙氨酸和酪氨酸发酵机制,七、苯丙氨酸的工业生产,八、酪氨酸代谢调控机制,九、酪氨酸的生产,一、芳香族氨基酸性质简介芳香族氨基酸-分子中都含有苯环1、色氨酸 Trp 结构式：性质：白色至黄白色晶体或结晶性粉末。 无臭或微臭，稍有苦味。熔点289，长时间光照则着色。与水共热产生少量吲哚。如在氢氧化钠、硫酸铜存在下加热，则产生多量吲哚。色氨酸与酸在暗处加热，较稳定。与其他氨基酸、糖类、醛类共存时极易分解。如

2、无烃类共存，与5mol/L氢氧化钠共热至125仍稳定 。用酸分解蛋白质时，色氨酸完全分解，生成腐黑物。略溶于水（1.1g/100ml，25）。,2、苯丙氨酸 Phe结构式：性质： 苯丙氨酸系统命名为“2-氨基苯丙酸”，是-氨基酸的一种，具有生物活性的光学异构体为L-苯丙氨酸（L-Phenylalanine）比旋光度为-35.1。苯丙氨酸是人体必需氨基酸之一，常温下为白色结晶或结晶性粉末固体，减压升华，溶于水，难溶于甲醇、乙醇、乙醚。苯丙氨酸广泛用于医药和阿斯巴甜的主要原料。L-苯丙氨酸在生物体内可被辅酶四氢生物喋呤不可逆地转化为L-酪氨酸（L-Tyrosine），后继续分解，经转氨基生成少量苯

3、丙酮酸，但先天性苯丙氨酸羟化酶缺陷患者，苯丙氨酸不能羟化生成酪氨酸，苯丙酮酸生成就增多，在血和尿中出现苯丙酮酸，导致智力发育障碍，称为苯丙酮尿症（PKU），故此类患者应忌食含苯丙氨酸的食品。,3、酪氨酸 Tyr结构式：性质： 学名：2-氨基-3-对羟苯基丙酸。一种含有酚羟基的芳香族极性氨基酸。L-酪氨酸是组成蛋白质的20种氨基酸中的一种，是哺乳动物的必需氨基酸，又是生酮和生糖氨基酸。符号：Y。酪氨酸是酪氨酸酶单酚酶功能的催化底物，是最终形成优黑素和褐黑素的主要原料。在美白化妆品研发中，可以通过研究合成与酪氨酸竞争的酪氨酸酶结构类似物也可有效地抑制黑素的生成。白癜风患者吃含有酪氨酸的食物可以促进

4、黑色素的形成，减轻白癜风症状。,二、芳香族氨基酸的生物合成途径,生物合成途径特点：,从4-磷酸赤藓糖与磷酸烯醇丙酮酸合成3-脱氧-D-阿拉伯糖型庚酮糖-7-磷酸（DAHP）到分支酸，是Phe、Tyr和Trp的共同途径；从分支酸到预苯酸（PPA）， 是Phe和Tyr的共同途径；在分枝酸处，倾向于优先合成氨茴酸；在预苯酸处，倾向于优先合成对羟苯丙酮酸。即优先合成顺序是： Trp- Tyr- Phe。,三、芳香族氨基酸的代谢调控机制,大肠杆菌中有三种DAHP合成酶谷氨酸棒杆菌中，在芳香族氨基酸生物合成途径中受调节控制的关键酶：DAHP合成酶（DS）、分枝酸变位酶（CM）、预苯酸脱氢酶（PD）、预苯酸

5、脱水酶（PT）和氨茴酸合成酶（AS） 黄色短杆菌中有一种DAHP合成酶，代谢调节较易控制,1、大肠杆菌中芳香族氨基酸生物合成途径与代谢控制,DAHP合成酶分支酸变位酶PPA脱氢酶PPA脱水酶氨茴酸合成酶,2、在黄色短杆菌中芳香族氨基酸生物合成的调节机制,DSDAHP合成酶CM分支酸变位酶PD预苯酸脱氢酶PT预苯酸脱水酶AS氨茴酸合成酶,四、色氨酸发酵机制,色氨酸生产菌的遗传标记位置色氨酸代谢调控机制（大量生成和积累色氨酸）切断支路代谢，选育苯丙氨酸和酪氨酸双重缺陷型（phe-+tyr-）的突变株； 然后遗传性的解除色氨酸自身的反馈抑制和阻遏及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸对DAHP合成酶的反馈调节；

6、选育色氨酸多重结构类似物抗性突变株；在发酵过程中限量添加苯丙氨酸和酪氨酸。,五、色氨酸的生产,L-色氨酸的生产最早主要是依靠化学合成法和蛋白质水解法制造。随对微生物法生产色氨酸的研究的不断发展，人们开始利用微生物法发酵生产色氨酸。现已走向实用并且处于主导地位。微生物法大体可分为微生物发酵法和酶促转化法。近年来还出现了直接发酵法和化学合成法，直接发酵法和转化法相结合生产色氨酸的研究。另外，基因工程、酶的固定化和高密度培养等技术在微生物育种和酶工业上的应用极大地推动了直接发酵法和酶法生产色氨酸的工业化进程。1、蛋白质水解法L-色氨酸的生产最早主要是依靠蛋白质水解法和化学合成法制造。蛋白质水解法是以

7、毛发、血粉及废蚕丝等蛋白质为原科，通过碱水解法和酶水解法生产L-色氨酸。随着氨基酸生产技术的发展，现在已很少使用该法生产L-色氨酸。,2、化学合成法化学合成法就是利用有机合成和化学工程相结合的技术生产或制备氨基酸的方法。DL-色氨酸的化学法合成，大致可分为以吲哚为原料的合成法和以苯肼为原料的合成法两种。Snydcr和MacDonald研究出了一种简单的合成DL-色氨酸的方法，即在乙酸和乙酸酐的存在下利用吲哚和-乙酰氨基丙烯酸直接缩合，得到N-乙酞-DL-色氨酸，此物质在氢氧化钠溶液中水解即可得到DL-色氨酸，收率为57.7%。Moe和MacDonald报道以苯肼为原料合成色氨酸，即在乙酸钠存在

8、下，将丙烯醛和乙酰氨基丙二酸二乙酯缩合，缩合体再与苯肼反应而生成苯腙，苯腙在H2S04或BF3水溶液中回流水解，环化得到化合物3-吲哚基-甲基-乙酰氨基-丙二酸二乙酯，将此化合物水解脱羧可得DL-色氨酸。化学合成法的最大优点是在氨基酸品种上不受限制，既可制备天然氨基酸，又可制备各种特殊结构的非天然氨基酸。但这并不意味着具有工业生产价值，由于合成得到的氨基酸都是DL-型外消旋体，必须经过拆分才能得到人体能够利用的L-氨基酸。故用化学合成法生产DL-色氨酸时，除需考虑合成工艺条件外，还要考虑异构体的拆分与D-色氨酸异构体的消旋利用，三者缺一不可。因此，化学法合成L-色氨酸在工业上的应用也受到一定的

9、限制。,3、酶促转化法酶法是利用微生物中L-色氨酸生物合成酶系的催化功能生产L-色氨酸的，能够利用化工合成的前体物为原料，既充分发挥了有机合成技术的优势，又具有产物浓度高、收率高、纯度高、副产物少、精制操作容易等优点，是一种成本较低的生产色氨酸的工业化生产方法。目前在L-色氨酸的生产中应用较为广泛。这些酶包括色氨酸酶、色氨酸合成酶、丝氨酸消旋酶等。根据提供这些酶的微生物种类数，可以分为双菌酶法和单菌酶法两种类型。酶促转化法既可以直接利用高活性色氨酸合成酶、色氨酸酶，或者具有高活性色氨酸合成酶或色氨酸酶的菌体催化L色氨酸的合成，也可以将酶或菌体固定化后进行L-色氨酸的合成。菌体和酶固定化后具有提

10、高酶的稳定性便于反复使用，便于实现生产连续化和自动化等优点。,4、微生物发酵法：微生物发酵法包括直接发酵法和添加前体发酵法。4.1直接发酵法直接发酵法是以葡萄糖、甘蔗糖蜜等廉价原料为碳源，利用优良的色氨酸生产菌株，在合适的发酵条件下，直接发酵生产色氨酸。选育高产稳产的色氨酸优良菌株是直接发酵法研究的中心问题在育种技术方面，传统的诱变育种国内外进行了大量的研究。Shiio等以黄色短杆菌酪氨酸缺陷型、对氟苯丙氨酸(4FP)抗性变异株为出发菌株，选育5-氟色氨酸(5-FT)抗性变异株No187，该菌株可产L-色氨酸80 g/L。继续以No187为亲株选育具有邻氨基苯甲酸结构类似的重氯丝氨酸(AsaS

11、er)抗性变异株A100，其产酸率提高到lO3 g/L，再从A-100选育磺胺胍(SG)抗性变异株S-225，其产酸率进一步提高到19g/L。国内的张素珍等人以亚硝基胍处理北京棒杆菌AS1.299，得到CG45突变株。该菌株具有5MT，6FT，4MP抗性标记，且以精氨酸和尿嘧啶为必需生长因子，在含12%葡萄糖的培养基中，30振荡培养5天。可积累色氨酸8g/L。该方法研究比较早，但在相当长的时间内无法达到工业化生产的要求。主要原因是从葡萄糖到色氨酸的生物合成途径比较长，其代谢流也比较弱，而且色氨酸的合成需要多种前体物质(PRPP、谷氨酰胺、L-丝氨酸等)。,要想进一步提高L-色氨酸的产量还必须提

12、高这些前体物的产量。另一方面色氨酸生物合成途径中的调节机制比较复杂，除了存在多重反馈调节外，还存在着弱化子系统。这使得色氨酸成为氨基酸发酵工业中最难发酵的氨基酸之一随着DNA重组技术的在微生物育种中的应用，为优良色氨酸菌种的筛选提供了可靠的技术保证。使得产酸水平逐渐达到工业化生产的要求。KatsumataR等将带有DAHP合成酶(DS)和色氨酸合成酶(TS) 基因的重组质粒引入产L-色氨酸43g/L的谷氨酸棒杆菌KY10-894中，使该工程菌株的L-色氨酸产量达到了66g/L产酸水平提高了54%。4. 2 添加前体发酵法该法又称为微生物转化法，它是使用葡萄糖作为碳源，同时添加合成色氨酸所需的前

13、体物(如邻氨基苯甲酸、吲哚、L-丝氨酸等)，利用微生物的色氨酸合成酶系转化前体来合成L-色氨酸。这种方法很早就投入了工业化生产，目前世界上最大的色氨酸生产厂家日本的昭和电工公司就是采用以邻氨基苯甲酸为前体物，利用Hansenula(汉逊氏酵母)或Bacillus(芽孢杆菌)菌种将其转化为色氨酸的生产方法，Yokozcnki等以DL-5-吲哚-甲基海因为原料，利用黄杆菌T-523分解其为色氨酸，可产L-色氨酸71 g/L。Fukui等由枯草杆菌选育5-氟色氨酸(5-FT)抗性突变株，在含l%葡萄糖和5%可溶性淀粉培养基中，连续流加邻氨基苯甲酸，可积累L-色氨酸96g/L。,Nakayarna等进

14、一步改造该突变株，使其具有5-FT和8-氮鸟嘌呤(8-AG)双重抗性，在含10%葡萄糖培养基中，连续流加邻氨基苯甲酸，可积累L-色氨酸156g/L。微生物转化法的不足之处在于当转化液中前体物浓度较高时，转化率有所下降，但可以通过分批次少量流加前体减少其抑制作用。另外，前体物价格比较昂贵，不利于降低成本。因此，有人研究利用发酵法廉价提供一种前体物，再结合其它方法的优势进行色氨酸的生产。Hajimu MOrikota等利用黄色短杆菌P390直接发酵L-谷氨酸-半醛(GSA)达132g/L，然后将发酵液适当稀释后加入苯肼的1mol/LH2S04溶液中加热回流1小时之后，48%的GSA可转化为L-色氨

15、酸。SMgeru oita等利用硫辛酸和硫胺素双重缺陷性菌株Enterobacter aetogene LT-94，在含5%的葡萄糖培养中产丙酮酸30g/L，然后再通过添加吲哚和氯化铵，利用该菌的色氨酸酶酶促转化L-色氨酸167%。,生产流程图：,六、苯丙氨酸和酪氨酸发酵机制,苯丙氨酸代谢调控机制首先切断芳香族氨基酸生物合成向酪氨酸和色氨酸的代谢支路，选育色氨酸和酪氨酸双重缺陷型（tyr-+trp-）突变株； 然后遗传性的解除苯丙氨酸自身对预苯酸脱水酶和分支酸变位酶的反馈抑制和阻遏，及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸对DAHP合成酶的反馈调节； 选育苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸多重结构类似物抗性突变株；

16、发酵中限量添加酪氨酸和色氨酸，使苯丙氨酸大量积累。,七、苯丙氨酸的工业生产,1、制备：苯丙氨酸的工业生产主要有蛋白质水解提取法，直接发酵法，化学合成等。化学合成法有苯甲醛法和苯乙醛法。 （1） 苯甲醛法： 以苯甲醛和乙酰甘氨酸作用生成乙酰氨基桂皮酸，然后催化加氢还原，得乙酰-DL-苯丙氨酸，最后经氨基酰化酶水解，可拆分生成本品。 利用氨基酰化酶的专一性，只水解Ac-L-phe的酰氨键，生成本品，而不能水解Ac-D-phe的酰胺。然后根据本品和Ac-D-phe在水中的溶解度不同进行分离。而分离出的Ac-D-phe又可经消旋化生成Ac-DL-phe。再一次重复水解、分离。依次类推，可将Ac-DL-

17、phe全部转化为本品。 固定化氨基酰化酶的制备：将DEAE-sephadexa-50放入去离子水中充分浸泡后，再依次用10倍量的0.5mol/LHCl和0.5mol/LNaOH溶液充分搅拌处理30min。然后用去离子水洗至中性，最后分别用0.1mol/L及0.01mol/L的pH=7.0的磷酸缓冲液处理1-2h，滤干，备用。取经培养40-50h的米麯扩大麯，用其6倍量的支离子水分2次提取，提取液用2mol/L的NaOH溶液调pH至6.7-7.0。然后按100L酶液和1kg湿DEAE-sephadex A-50的比例混合，于0-4搅拌吸附4-5h后，过滤取DEAE-sephadexA-50，并分

18、别用去离子水0.1mol/LNaAc溶液、0.01mol/L的pH=7.0的磷酸缓冲液洗涤3-4次。过滤得固定化氨基酰化酶，加1%甲苯放入冷库中贮存备用。,酶水解：在1000L水解罐中，加入700L0.1mol/L的Ac-DL-phe钠盐溶液，再逐步加入6mol/L的HCl调溶液pH至6.7-7.0，再加入15-20kg固定化氨基酰化酶，维持50约4h进行酶选择性水解反应后，过滤取滤液，得酶水解液(含本品和Ac-D-phe混合液)。 分离：将酶水解液用6mol/L的HCl调pH至4.8-5.1，减压浓缩至35L左右，并将其放置于0结晶过夜，过滤取结晶，用10L冷乙醇洗涤，于80烘干3-4h，得

19、本品的粗品，滤液和洗涤液合并，减压浓缩至20L左右，得Ac-D-phe溶液，待外消旋化后再重复进行酶水解、分离。 Ac-D-phe的外消旋化：将Ac-D-phe溶液60L，加入100L反应罐中，加入醋酐18.5L，在25-45，搅拌30min，冷却放置6h。再用浓HCl调pH值至1.5-2.0，5结晶过夜，过滤取结晶，水洗，滤干40真空干燥，得Ac-DL-phe。 精制：在100L反应罐中，加入5kg本品的粗品，加50L去离子水，加热至100，搅拌使其全溶，再加入药用活性炭0.25kg，搅拌脱色半小时后，趁热过滤，滤液移入200L结晶罐中，冷却至40，加入50L，40的95%乙醇，用6mol/

20、L的HCl调pH至5.48，于0结晶过夜，过滤取结晶，用95%乙醇洗涤，抽干，80干燥3-4h，得本品的成品。母液再回收。,（2）、苯乙醛法： 适用Bucherer反应，生成苯甲基乙内酰脲，然后碱性解得DL-苯丙氨酸(DL-phe)。将DL-phe与醋酐作用生成Ac-DL-phe后，按上述方法进行拆分，可得本品。,2.L-苯丙氨酸(63-91-2)的质量标准： 中国药典2000年版 指标名称 指标 C9H11O2含量/% 98.5 比旋度(20mg/mLH2O) 33.035.0 溶液颜色、澄清度 无色澄清 溶液的透光率(0.50g/25mLH2O,430nm)/% 98 PH值 5.46.0

21、 氯化物/% 0.02 硫酸盐/% 0.02 铵盐/% 0.02 其他氨基酸/% 0.02 干燥失重/% 0.2 炽灼残渣/% 0.1 重金属 0.0002 铁盐/% 0.001 砷盐/% 0.0002 热原 符合规定,3.贮藏： 密闭保存。4.注意事项： 可影响甲状腺激素和毛发、皮肤的黑色素。最低需求量(mg/kgd)：成年男子31，幼儿169。5.L-苯丙氨酸(63-91-2)的推荐用量：(1)占食品中总蛋白量的5.8%。(2)FEMA(mg/kg)：焙烤食品110；冷冻乳品60.0；肉制品10.0；软糖268；明胶、布丁60.0；乳制品66.0；调味品10.0；糖果和糖霜268；甜沙司2

22、20。,6.鉴定试验：(1)取本品的水溶液(11000)5mL，加重铬酸钾溶液(11000)1mL煮沸，产生特有的臭气。 (2)取本品水溶液(11000)5mL，加茚三酮试液1mL，加热3min，呈现红紫蓝紫色。(3)取本品10mg，加硝酸钾0.5g及硫酸2mL，水浴加热20min后，加盐酸羟胺溶液(110)5mL，在冰水中放置10min冷却后，立即加40%氢氧化钠溶液8mL，放置，呈现红紫色。熔点 270-275 C7.L-苯丙氨酸(63-91-2)的纯度试验： (1)溶解性：将本品0.2g溶于20mL水中，无色，其浊度应在透明以下。 (2)酸碱性：本品水溶液(1100)的pH值用玻璃电极法

23、测定必须是5.46.0。 酸度 取本品0.20g，加水20ml溶解后，依法测定（附录 H），pH值应为5.4-6.0。 (3)比旋光度：本品在105干燥3h后，精确称量约1g，溶在水中至50mL，测定此液旋光度必须是-33-35。 (4)氯化物：取本品0.5g，进行氯化物的常规试验，其量在0.01mol/L盐酸0.3mL对应量以下。,(5)铵盐：按L-天门冬氨酸钠的纯度试验(5)进行，但氨标准溶液用2mL。 (6)砷：取本品0.5g，加2mol/L盐酸10mL，作为检液进行砷的常规试验，应符合要求。 (7)重金属：取本品1g，加稀醋酸2mL及水40mL溶解，作为检液进行重金属的常规试验，其量必

24、须在0.002%以下。 (8)其它氨基酸：按L-天门冬氨酸钠的纯度试验(8)进行。 (9)干燥失重：本品在105干燥3h，失重应在0.3%以下。 (10)强热残留物：本品的强热残留物应在0.1%以下。 非水滴定 (11)定量法：本品在105干燥3h后，精确称量约0.3g，以下按DL-丙氨酸的定量法进行。0.1mol/L高氯酸溶液1mL=16.52mg的C9H11NO2 温度 0 20 40 60 80 100 溶解度 1.98 2.74 3.77 5.20 7.18 9.90 含量测定: 取本品约0.13g，精密称定，加无水甲酸3ml溶解后，加冰醋酸50ml，照电位滴定法（附录 A），用高氨酸

25、滴定液（0.1mol/L）滴定，并将滴定的结果用空白试验校正。每1ml高氯酸滴定液（0.1mol/L）相当于16.52mg的C9H11NO2。,L苯丙氨酸红外测定羧基吸收峰：1600 -1 羧酸负离子吸收峰：1720 -1溶液的透光率 取本品0.50g，加水25ml溶解后，照紫外-可见分光光度法（附录 A），在430nm的波长处测定透光率，不得低于98.0%。,注 解 本品对水的溶解度(g/dL)如上： 苯丙氨酸用重酪酸钾氧化，引起脱氨、脱碳酸生成苯乙醛。此物有风信子样的香气，故可用于鉴别苯丙氨酸。 将苯丙氨酸硝基化在碱性条件下与羟胺作用使其发色。可用作定量法(定量)。 本品的解离常数pKCO

26、OH=1.83 pKNH3+=9.13，pI=5.48。 Cl的限量是0.021%。 NH4的限量是0.02%。 As2O3的限量是2ppm。 Pb的限量是20ppm。 在本条件下苯丙氨酸的Rf值约0.61。其它的氨基酸的检测界限，在酸性、中性氨基酸中大约是0.050.1g。8.其他： 疏水参数计算参考值(XlogP)：-1.5； 氢键供体数量：2； 氢键受体数量：3； 可旋转化学键数量：3； 拓扑分子极性表面积(TPSA)：63.3; 重原子数量：12。,八、酪氨酸代谢调控机制 1、首先切断芳香族氨基酸生物合成向色氨酸和苯丙氨酸的代谢支路，选育；色氨酸和苯丙氨酸双重缺陷型（ Phe -+tr

27、p-）突变株； 2、 然后遗传性的解除酪氨酸自身的反馈抑制和阻遏， 及苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸对DAHP合成酶的反馈调节； 3、选育苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸多重结构类似物抗性突变株； 4、发酵中限量添加苯丙氨酸和色氨酸，使酪氨酸大量积累。,九、酪氨酸的生产1、由含蛋白质的物质（废丝、酪蛋白和玉米等）水解液中提取；2、以葡萄糖为原料，经短杆菌出发诱导的l-酪氨酸生产菌发酵而得；3、以苯酚、丙酮酸、氨为原料，利用-酪氨酸酶催化制取。,参考文献：1、芳香族氨基酸和其他氨基酸发酵机制（百度文库）2、氨基酸（百度文库）3、张克旭，氨基酸发酵工艺学. 中国轻工业出版社，20024、部分来自百度百科5、网络素材6、微生物工程工艺原理（百度文库）7、李艳，发酵工程原理与技术 高等教育出版社,谢谢！,