微透析技术与方法研究生.ppt

1、微透析技术与方法,洪 宗 元,皖南医学院定量药理研究所,微透析技术是一种微量化学采样与检测技术,微透析技术,微透析系统组成微透析技术原理微透析技术特点透析相关仪器及透析液微透析实验操作微透析实验的注意事项,一、微透析系统组成,二、微透析技术原理,微透析探头是由具有一定截留分子量的纤维半透膜制成(microdialysis probe，MDP)；将探头埋入待测的组织区域，以恒定速度向探头内灌注与组织液成分相近的等渗灌流液；当灌流液流经探头前端透析膜时，组织内小分子量生物活性物质即顺浓度梯度从膜外扩散入膜内，并随灌流液被引流至探头外；按一定的时间间隔连续收集透析液，检测其中待测生物活性物质水平，可

2、监测该区域内细胞外生物活性物质浓度的经时变化过程,微透析技术原理优点,组织损伤小、取样少、方便、快捷、可连续监测且易实现自动化等优点。,微透析系统示意图-Anesthesized rats,Anesthesized rats,微透析系统示意图- Freely moving rats,MDP：常用管式半透膜与不锈钢、石英或塑料毛细管构成，半透膜由再生纤维素、聚碳酸脂或聚丙烯腈制成。截留分子量 5,000-100,000 dolton不等。适合神经递质等小分子物质通透，而蛋白质难以通透 ；,三、微透析技术特点,灌流液：脑微透析的灌流液一般采用人工脑脊液 (artificial cerebral s

3、pinal fluid, aCSF)、Ringer或 Krebs 溶液；,检测方法：,微透析技术特点(续）,-单胺类物质测定主要采用高效液相色谱 (HPLC-ECD 法；,-氨基酸类物质多用 HPLC-荧光法测定；,-乙酰胆碱、乳酸、抗坏血酸、丙酮酸和嘌呤类等物质多采用 HPLC-紫外检测法；,-神经肽类物质主要用放射免疫法测定。,（一）微透析探针,组成成分：小口径的透析膜、硅管、防水万用胶、硅胶毛细管,1.橡胶管；2.硅胶管（silica tubing）粗管；3.硅胶管（silica tubing）细管；4.聚乙烯管(PE-10 (polyethylene tubing)；5.透析膜（Dia

4、lysis membrane）；6.环氧乙烷（epoxy adhesive）；7.注射针头。,四、透析相关仪器及透析液,（二）透析泵,1.流速稳定且缓慢，介于 1-5l/min,2.快速的前进/后退模式，连续而可调整的流速，和微调控制选择（microprocessor control option）,3.液体转动轴（liquid swivel）:动物可自由行动，不会被透析管缠住,4.常用透析泵 CMA/100, Harvard Microliter , Sage Model 341A,（三）透析液转换器,Carnegie Medicine 公司发展了一个全自动的透析液转换器 CMA/110 及

5、 CMA/111。因这个机器有微调的功能，马达驱动的设备，来转换透析液，在转换过程中不会让空气进入。,（四）透析液收集,1.手动收集透析液 虽然耗时间，但可使一台 HPLC 发挥最大功用。例如收集时间要 20 分钟，测定一个样品只要 7-8 分钟，则一台 HPLC 力足以应付 3 种样品；使样品分离和分析很明确,2.自动收集器 (CMA/140) 按一定间间隔将透析液收集在冷藏（refrigerated）设备的旋转盘上的玻璃小瓶内,这就不需在实验过程中一直看守着仪器。但就无法一边收一边分析透析液,3.在线收集与检测 (Online)将探针出口直接连到 HPLC 的承载阀（load-valve）

6、上，而直接在线上自动分析透析液。即把一台 HPLC 限制在单一动物身上，使透析实验全自动化,（五）灌流液 (perfusate),1. Ringers solution：, 140 mM NaCl 3.0 mM KCl 1.2-3.4 mM CaCl2 1.0 mM MgCl2, 1.2 mM Na2HPO4 0.27 mM NaH2PO4 7.2 mM glucose pH 7.4,2. 人工脑积液 (artificial cerebrospinal liquid, aCSF), 147 mM Na+ 4.0 mM K+ 2.0 mM Ca2+,大多数微透析使用的透析液，都含有1-3.4 m

7、M 浓度的钙离子。动物组织不同区域，钙离子浓度从1-3 mM 不等。透析液中含有3.4 mM 和含有1.2 mM 钙离子时，对药物引起的 DA 变化，会有定量的（quantitative）不同。目前我们虽知透析液中钙离子的含量，对单胺的释出有影响，但影响的程度则未知。组织间的不同差异，钙离子可能是一个影响因素。,（六）透析液中钙离子的浓度,五、微透析实验操作,（一）透析探针的植入,1.必须的仪器：外科器械、钻孔机、立体定位仪,2.定位软件、图谱：,Paxinos, G., and W. C. (1997) The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates (Th

8、e Third Edition): San Diego, Academic Press.,Paxinos, G., and F. K. B. J. (2001) The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates (The Second Edition): San Diego, Academic Press.,（二）微透析探针植入前的准备,1.手术前，将透析探针（储存在干的状态下）连上透析系统，并安置在立体定位仪的把手。,2.将把手夹在一个小蒸馏架上，将探针浸到含有透析液的烧杯中，使透析膜完全浸湿和微微张开。一旦透析膜弄湿后，就不可将透析膜移出溶液，因为透析膜

9、干掉后，会影响单胺的回收率。,3.检查透析膜，确定它是流通而不渗漏的；并排空系统内气体。,（三）麻醉,1.非复原性（急性实验 acute preparation）,实验进行中，用加温毯或台灯将动物体温维持在 37 C。,手术（30min），然后等 2 小时作基础值测定期（baseline period）,看(单胺释出量)有否趋于稳定，然后药物注射之后，继续测定 2 小时左右的给药测定期（post-drug）。,用 chloral hydrate 或 urethane麻醉，麻醉时间较长,用 pentobarbital 或 halothane (0.15% halothane/air mixtur

10、e, air mixture: 95% O2 + 5% CO2)麻醉,Halothane麻醉恢复快又比较不会发生意外,但要求小动物麻醉机,2.自由活动实验（慢性实验 chronic preparation）,需要液体转动轴，动物在自由运动的情形下，不受限制地收集透析液,需要适当的动物活动室(动物行为合乎生理状况,如隔音、保温、保湿、光控等),六、微透析实验的注意事项,（一）组织损害,脑组织急性植入小导管或探针，导致立即地，但数分钟到数小时内可恢复的变化，如在探针邻近区域，, 组织被压凹， 血脑障壁被破坏， 葡萄糖代谢受影响， 神经元损害,微透析探针植入几天，透析膜附近的组织，立即发生神经胶质（

11、gliotic）反应，结果造成炎症细胞和结缔组织覆盖在半透膜上，形成障壁（barrier）阻碍透析进行。例如：,（二）慢性实验过程,探针植入后几天，基本的单胺释出和药物引起的单胺释出都会下降,无论是术后 4 天纹状体的 DA,还是术后 7 天海马回的 5-HT，其基本的释出量仍都与钙离子相关，暗示它们都源自神经元,HPLC-ED 分析单胺及其代谢物实验。(A)单胺及其代谢物标准品。(B)纹状体透析液。1. norepinephrine; 2. epinephrine; 3. dopamine; 4. DOPAC; 5. 5-HIAA; 6. HVA; 7. 3-MT(3-methoxytyramine); 8. 5-HT.,