高效免疫调节剂对人宫颈癌HeLa细胞增殖的影响.doc

1、1高效免疫调节剂对人宫颈癌 HeLa 细胞增殖的影响摘 要：目的：观察高效免疫调节剂（HIS）对人宫颈癌 HeLa 细胞增殖的影响。方法：制备 HIS 含药血清，采用 MTT 法检测 HIS 含药血清对 HeLa 细胞增殖的影响，Annexin/PI 双染色流式细胞术检测细胞凋亡。结果：与对照组比较，HIS 含药血清对 HeLa 细胞生长有一定的抑制作用（p0.01） ，并呈明显的时效量效关系；而随着 HIS 剂量的增加，各含药血清组细胞凋亡比例亦相应增加，与对照组比较有显著性差异（p0.01） 。结论：HIS 对宫颈癌细胞生长有明显的抑制作用，同时可以调节细胞周期，促进细胞凋亡。 关键词：高

2、效免疫调节剂；人宫颈癌 HeLa 细胞；增殖 宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤，严重威胁广大妇女的生命和健康。宫颈癌的治疗是一个及其复杂的过程，如何纠正宫颈癌患者的整体免疫系统恢复到正常和协调上来，恢复机体的免疫监视，防止肿瘤的发生、发展和转移是宫颈癌治疗的关键之一。为此，我们采用多价疫苗组成的高效免疫调节剂（high-efficiency immune modulators， HIS） ，制备成含药血清，对人宫颈癌 HeLa 细胞进行体外培养，观察 HIS 对宫颈癌细胞增殖的影响。 1 材料 1.1 动物及细胞株 雄性 SD 大鼠，体重 250-280g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公2司（动物

3、中心许可证号：SCXK（湘）2011-0003，动物合格证号：43004700003244，级别：SPF 级） 。人宫颈癌 HeLa 细胞人肝癌细胞株Bel-7402，由中国医学科学院医药研究所购进，赣南医学院科研中心传代培养。 1.2 药品和试剂 胎牛血清（Gibco，10099-141） 、1640 培养基（Gibco，12800-058） 、0.25%胰酶（Gibco，25200-056） 、MTT Formazan（Sigma，M2003-1G） 、PI Annexin apoptosis detection kit（美国 BD 公司，3018688） 2. 方法 2.1 实验药物配置

4、 HIS（中国发明专利申请号：200810107096.6）由江中肿瘤治疗研究组提供，将其配置成 0.3 g/mL，此为中剂量，再分别浓缩、稀释成 0.9 g/mL、0.1 g/mL，此为高、低剂量。4冰箱保存，大鼠按 0.1 mL/100 g 腹股沟皮下注射给药，每日一次。 2.2 含药血清制备 将 20 只清洁级 SD 大鼠随机分成 4 组：A、正常对照组；B、HIS 低剂量组；C、HIS 中剂量组；D、HIS 高剂量组。A 组每天腹股沟皮下注射生理盐水 0.1mL/100g；B、C、D 组分别给予低、中、高剂量 HIS 腹股沟皮下注射 0.1mL/100g；连续治疗 3 天，于末次给药

5、1h 后，乙醚麻醉，腹主动脉取血，分离血清。将同组大鼠血清混匀， 56，30min 水浴灭活，0.22m 薄膜滤菌器过滤，密封冷藏备用。 2.3 宫颈癌细胞 HeLa 的复苏与培养 3HeLa 细胞株复苏，CO2 孵箱（5%CO2，37，95%湿度）传代培养，3代后用于以下实验。 2.4 MTT 法检测 HIS 含药血清对 HeLa 细胞增殖的影响 将细胞数量调整为 510/mL 接种至 96 孔培养板，每孔 200uL，分 4组（正常血清对照组，HIS 含药血清低、中、高剂量组） ，每组 8 个复孔，培养 24h 后弃培养液， 加含 10%各组相应血清的 1640 培养液，继续培养24h、4

6、8h、72h 后，每孔加入 MTT 20L，37作用 4h，弃培养液，加入二甲基亚砜 100L，37、l0min 轻轻摇动培养板，上机检测，计算细胞增殖抑制率。 2.5 Annexin/PI 双染色流式细胞术检测细胞凋亡 常规培养 24h 后弃培养液， 加含 10%相应血清的 1640 培养液继续培养 48h，弃培养液，胰酶消化，收集细胞，离心，弃上清。取适量Annexin Binding Buffer 重悬，计数，调细胞剂量为 1106 个/mL，取 40uL 细胞（即 4104 个）放入离心管中。每管加 Annexin、PI 各2uL，混合后避光放置 15min，上机检测。 3 实验结果

7、3.1 HIS 含药血清对 HeLa 细胞增殖的影响 与对照组比较，各组 HIS 含药血清对 HeLa 细胞生长有一定的抑制作用（p0.01） ，并呈明显的时效量效关系。提示 HIS 含药血清能够抑制宫颈癌细胞 HeLa 的增殖。 （见表 1） 3.2 Annexin/PI 双染色流式细胞术检测细胞凋亡 实验结果表明，随着 HIS 剂量的增加，细胞凋亡比例亦相应增加，4分别为：（11.261.59）%、 （17.671.72）%、 （24.581.86）%，与正常血清对照组（6.921.07）%比较有显著性差异（p0.01）提示 HIS含药血清可以促进 Bel-7402 细胞凋亡。 4 讨论

8、宫颈癌是指发生在宫颈阴道部或移行带的鳞状上皮细胞及颈管内膜的柱状上皮细胞交界处的恶性肿瘤，其治疗是一个复杂的过程，目前临床常见的治疗手段是手术和放、化疗，其疗效值得肯定，但仍存在着一些弊端和毒副作用。 在动物实验中，我们观察了 HIS 对 S180 肉瘤小鼠肿瘤的影响，结果证实 HIS 可有效增强小鼠免疫功能1，同时促进肿瘤细胞凋亡 2。本次实验我们制备 HIS 含药血清，对人宫颈癌 HeLa 细胞进行体外培养，观察 HIS 对宫颈癌细胞增殖的影响。结果表明 HIS 能够有效抑制 HeLa 细胞的增殖，促进细胞凋亡，这为进一步在临床应用 HIS 治疗宫颈癌提供了实验依据。 参考文献 1常欣峰，宋春花，罗宝英，等. 高效免疫调节剂对 S180 肉瘤小鼠 IL-6 及 IL-10 表达的调节作用J.长春中医药大学学报，2013，29（12）：958-960. 2常欣峰， 宋春花， 张志花，等. 高效免疫调节剂促进肉瘤小鼠肿瘤细胞凋亡实验研究J.吉林中医药，2013，33（7）：717-719.