一株高产蛋白酶菌株的筛选及其产酶条件.DOC

1、一株高产蛋白酶菌株的筛选及其产酶条件 林玩庄，林淑娜，陈汶聪，刘荣莲，黄可佳，黄丹敏，谢桂仁，陈宇豹，邓毛程，王瑶，李静广东轻工职业技术学院，广州，510300摘要：为了提高水产行业蛋白质资源的综合利用率，从南海海域大型鱼类的肠道中筛选蛋白酶高产菌株。采用平板透明圈法和摇瓶发酵法进行筛选，获得一株蛋白酶高产菌株PE11。通过菌体形态观察、生理生化实验和 16S rDNA 鉴定，菌株 PE11 被鉴定为解淀粉芽孢杆菌 (Bacillus amyloliquefaciens)。通过摇瓶发酵试验，优选出可溶性淀粉和牛肉膏分别为最佳的碳源和氮源，并确定菌株 PE11 产蛋白酶的最佳条件为：温度 30

2、C、初始pH7.0、转速 200 rpm 和时间 36 h。在最佳的产酶条件下，发酵液中的蛋白酶活力可达 376 U/mL。关键词：蛋白酶；高产；筛选；产酶条件Study on screening and enzyme-producing conditions of a high protease producing strainLING Wan-zhuang, LING Shu-Na, CHEN Wen-cong, LIU Rong-lian, HUANG Ke-jia, HUANG Dan-min, XIE Gui-ren, CHEN Yu-bao, DENG Mao-cheng, WAN

3、G Yao, LI Jing(Guangdong Industry Technical College, Guangzhou 510300)Abstract：In order to improve the comprehensive utilization rate of protein resources from aquatic industry, strains having the ability to produce protease were isolated and screened from the gastrointestinal tract of large fish of

4、 South China Sea. Using flat transparent circle and shake flask fermentation test, a high producing protease strain PE11 was obtained. The strain PE11 was identified as Bacillus amyloliquefaciens through the systematic investigations of morphology, physiological and biochemical characteristics and 1

5、6S rDNA sequences analysis. By means of shake flask fermentation tests, the optimal carbon resource and nitrogen resource for strain PE11 were soluble starch and beef extract, respectively. In addition, the best conditions for protease-producing were determined as temperature of 30 C, initial pH of

6、7.0 and rotation speed of 200 rpm. At the optimal condition, the highest protease activity of fermentation broth reached 376 基金项目：广东高校特色调味品工程技术开发中心建设项目（GCZX-B1103） ，广东省教育部产学研结合项目（2012B091000040） ，广东轻工职业技术学院自然科学启动基金项目（KJ201307） ，广东轻工职业技术学院自然科学启动基金项目（KJ201203） 。第一作者简介：林玩庄（1994.11- ） ，女，研究方向为生物技术。U/mL.

7、Key words：protease；high producing；screening；enzyme-producing condition引言近年来，我国的水产养殖量和加工量一直居世界首位 1-2。但是，在捕捞和加工过程中，低值水产品往往占总产量的 30%50%3-4。如果这些低值水产品得不到高值化利用，将造成大量蛋白质资源的浪费。随着人们对低值水产品综合利用的重视，蛋白酶及其高产菌种的应用日益增加。为了直接利用高产蛋白酶菌种对低值水产品进行开发高值化产品，本实验主要筛选蛋白酶高产菌种，以及初步研究所得菌种的产酶条件。1 材料与方法1.1 筛选材料与试剂筛选材料：南海海域大型鱼类的肠道组织；

8、酪氨酸：分析纯，市售；Folin试剂及其它试剂：分析纯，市售。1.2 培养基富集培养基：葡萄糖 40 g/L，蛋白胨 10 g/L，酵母膏 5 g/L，Na 2HPO4 2 g/L，KH 2PO4 1 g/L，MgSO 47H2O 0.5 g/L，pH7.0。分离平板培养基：葡萄糖 10 g/L，酵母膏 5 g/L，脱脂奶粉 10 g/L，NaCl 1 g/L，琼脂 10 g/L，pH7.0。斜面培养基：葡萄糖 10 g/L，蛋白胨 10 g/L，酵母膏 5 g/L，琼脂 10 g/L，pH7.0。种子培养基：葡萄糖 10 g/L，蛋白胨 10 g/L，酵母膏 5 g/L，KH 2PO4 2

9、g/L，MgSO 47H2O 0.5 g/L，pH7.0。基础发酵培养基：葡萄糖 40 g/L，蛋白胨 5 g/L，K 2HPO4 1.5 g/L，MgSO 47H2O 0.5 g/L，pH7.0 。1.3 富集培养与平板初筛用组织捣碎器将鱼类肠道组织捣碎，取 10 g 接入 200 mL 的富集培养基中，于 28 C、200 rpm 的条件下培养 16 h。然后，将培养液进行梯度稀释，涂布于分离平板培养基上，于 28 C 培养 48 h，挑取具有透明圈的菌落，接入斜面培养基，培养 24 h，置于 4 C 冰箱内保藏，备用。1.4 摇瓶发酵筛选将平板初筛所得各菌株的斜面菌种接入种子培养基，于

10、26 C、150 rpm 的条件下培养 12 h。然后，按 10%的接种量将种子液接入发酵培养基，于 28 C、200 rpm 的条件下培养 36 h。测定发酵液中的蛋白酶活力，筛选出高产菌株。1.5 高产菌株的鉴定采用普通光学显微镜和扫描电镜对菌体形态进行观察，按Bergys Manual of Determinative for Bacteriology的方法对高产菌株的生理生化特征进行分析 5，参考文献介绍的 16S rDNA 鉴定方法对高产菌株进行分子生物学鉴定 6-7。1.6 碳源和氮源对产酶的影响改变基础发酵培养基的碳源和氮源，分别以葡萄糖、蔗糖、乳糖和可溶性淀粉为唯一碳源，分别以

11、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、硫酸铵、尿素为唯一氮源，经 36 h 摇瓶发酵，测定发酵液中的蛋白酶活力，根据结果选择最佳的碳源和氮源。1.7 环境条件对产酶的影响采用最佳的碳源和氮源配置发酵培养基，分别在不同的温度、初始 pH 和摇瓶转速下进行产酶发酵，测定各种环境条件下的蛋白酶活力，确定最佳的摇瓶发酵条件。1.8 产酶曲线的分析在最佳的摇瓶发酵条件下进行产酶发酵，每隔 6 h 测定发酵液中蛋白酶活性，根据蛋白酶活力变化情况，确定最佳的产酶时间。1.9 蛋白酶活力的测定采用 GB/T 23527-2009 中的 Folin 法测定发酵液中的蛋白酶活力 8。样品测定时，调节发酵液 pH 至 7.5，于

12、 4C、10000 rpm 下离心去除菌体，以 pH7.5的磷酸盐缓冲液对上清液进行适当稀释，取 1 mL 稀释液，加入 1 mL 酪蛋白溶液(10.0 g/L)，于 40 C 水浴中反应 10 min，再加入 1 mL 三氯乙酸溶液(65.4 g/L)终止反应，经过滤，取 1 mL 滤液，加入 5 mL 碳酸钠溶液 (42.4 g/L)和 1 mL Folin试剂，混匀，置于 40 C 水浴中显色反应 20 min，于 680 nm 波长下测定吸光值。在样品测定前，先配制一系列标准浓度的酪氨酸溶液，取 1 mL 标准溶液，按上述方法进行显色反应，于 680 nm 波长下测定吸光值，以酪氨酸浓

13、度为横坐标、吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。根据标准曲线的回归方程，计算样品反应液中的酪氨酸生成量，从而确定样品的蛋白酶活力。蛋白酶活力的定义为：在pH7.5 和 40 C 的条件下，1 min 水解酪蛋白生成 1 g 酪氨酸为 1 个活力单位(U) 。2 结果与讨论2.1 酪氨酸的标准曲线酪氨酸的标准曲线如图 1 所示。其线性回归方程为：y=0.0109 x + 0.0048，相关系数 R2 为 0.9997。 012304560.203.45.607 R2=.97y10x+.4868 nm下 下 g/mL图 1 酪氨酸标准曲线Fig.1 Standard cure of tyrosine2.

14、2 蛋白酶高产菌株的筛选通过对富集培养液进行平板分离，共挑取 32 株在菌落周围具有透明圈的菌株。采用摇瓶发酵方法对各菌株进行复筛，其中蛋白酶活力较高的 8 株菌株的发酵结果如图 2 所示。从图 2 可看出，菌株 PE11 发酵液中的蛋白酶活力最高，故被选为进一步研究的菌株。PE03614PE72354812064280 下 U/mL下图 2 8 株菌的摇瓶发酵筛选结果Fig.2 Screen result of 8 strains with shake flask fermentation test2.3 菌种 PE11 的鉴定在普通显微镜下，菌种 PE11 的革兰氏染色阳性。其扫描电镜(1

15、0,000)的摄像如图 3 所示，菌体呈杆状，大小约为(2.64.7) m (0.5 0.6) m。通过生理生化试验，结果如表 1 所示。通过形态特征和生理生化特征的分析，可初步判断菌种 PE11 为芽孢杆菌属。对菌种 PE11 的 16S rDNA 进行 PCR 扩增，PCR产物经纯化、测序，获得 1512 bp 的序列，经过在 NCBI 中对其同源性进行检索，发现菌种 PE11 与解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的许多菌种的同源性达 99%。其中，菌种 PE11 与 Bacillus amyloliquefaciens V3 (登录号:KJ123715

16、.1)的亲缘关系最近。采用 Neighbor-joining 法构建系统发育树，菌种PE11 的 系统发育树如图 4 所示。经过 16S rDNA 分子生物学的分析，菌种PE11 被进一步鉴定为解淀粉芽孢杆菌。图 3 菌种 PE11 的扫描电镜照片(10,000)Fig. 3 SEM photographs of cell morphology of strain PE11 (10,000)表 1 生理生化试验结果Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain PE11试验项目 反应结果芽孢染色氧化酶接触酶淀粉水解

17、明胶液化酪素水解甲基红试验V-P 试验形成吲哚葡萄糖发酵柠檬酸利用硝酸盐还原+-+注：“+”表示阳性， “-”表示阴性。Bacilus myloiqefacinsBIH 350(FJ8964.1)Ab-2K7il lifiZDS1 (M.)acsyeacsWY3JQ9681Strin PE1Bilu mloqfiV (K275.)acilus yoqefacisD6 (J2370.)liBGU19. btliMO (AY5.)acustilJ -36 (AB54291.) bisPRQBacilus btilIA 128 (NR126.)869 9190954668580.5图 4 菌种 PE

18、11 的系统发育树Fig.4 The sequence phylogenetic analysis of strain PE112.4 碳源和氮源对产蛋白酶的影响分别以不同碳源和氮源配制培养基，发酵结果如图 5 所示。对于不同碳源，有利于产蛋白酶的顺序为：可溶性淀粉乳糖蔗糖葡萄糖 (见图 5A)。张竹慧等研究角蛋白酶产生菌的产酶特性时，同样发现淀粉优于葡萄糖 9。对于能够利用淀粉等慢速碳源的菌种，慢速碳源的代谢可能更加有利于酶的合成。从图 5B 可以看出，有机氮源对蛋白酶产生的促进作用强于无机氮源，这可能与有机氮源含有诱导作用的肽链有关。在所用的氮源中，牛肉膏和蛋白胨的促进作用较为明显，其中牛

19、肉膏的促进效果最佳。实验结果与文献中一株枯草芽孢杆菌产蛋白酶的氮源筛选结果相似 10。下下05102530A U/mL下下05102530B U/mL图 5 碳源和氮源对产蛋白酶的影响 （A ：碳源；B：氮源）Fig.5 Effect of different carbon resource and nitrogen resource on yield of protease(A: carbon resource; B: nitrogen resource)2.5 环境条件对产蛋白酶的影响以可溶性淀粉和牛肉膏配制培养基，分别在不同的温度、初始 pH 和摇瓶转速下进行发酵，产蛋白酶结果如图 6

20、所示。温度对菌种 PE11 的产蛋白酶有明显的影响(见图 6A)，在 30 C 下发酵的蛋白酶活力最高。从图 6B 中可看出，初始 pH 过高或过低均不利于产酶，在 pH 为 7.07.5 范围内的产酶效果较好，其中在初始 pH 为 7.0 下发酵的蛋白酶活力最高。从文献报道来看，合成蛋白酶的发酵是好氧发酵 11-12，因而摇瓶转速可间接影响蛋白酶的合成。从图 6C 中可看出，在摇瓶转速 50200 rpm 的范围内，过低的摇瓶转速不能满足菌种对溶氧的需求，产酶效果随转速增加而呈上升的趋势，200 rpm 时的蛋白酶活力达到最高。当摇瓶转速增加至一定程度后，继续增加转速并不一定能够增大溶氧，菌

21、体反而因激烈振荡受到一定伤害，这可能是 250 rpm 时的蛋白酶活力略有下降的原因。因此，摇瓶发酵的最佳环境条件可确定为：温度 30 C、初始 pH7.0和转速 200 rpm。24628302051205340A 下 U/mL下 C6.0.57.0.58.0512053 B 下 U/mLpH50150250120534 C 下 U/mL下 rpm图 6 环境条件对产蛋白酶的影响A：温度；B：初始 pH；C：转速Fig. 6 Effect of fermentation conditions on yield of proteaseA: temperature; B: initial pH;

22、 C: rotation speed2.6 最佳条件下的产酶曲线在最佳发酵条件下，菌种 PE11 的产蛋白酶时间曲线如图 7 所示。从图 7 可看出，当发酵时间为 36 h，发酵液中蛋白酶活力达到最高，此时的蛋白酶活力为 376 U/mL。此后，蛋白酶活力随发酵时间延长而呈下降趋势。因此，在本实验条件下，最佳的产蛋白酶时间为 36 h。经查阅我国相关文献，在蛋白酶活力的测定方法和酶的活性单位定义的相同情况下，细菌发酵液中的最高蛋白酶活力大多居于 100200 U/mL 之间 13-14，少数居于 300400 U/mL 之间 15。现对于上述文献的报道，菌种 PE11 具有较强的蛋白酶产生能力

23、。0612843062485120354 下 U/mL下 h图 7 菌株 PE11 的产酶时间曲线Fig. 7 Time course of protease-producing of strain PE113 结论以南海海域大型鱼类的肠道组织为筛选材料，本实验筛选获得一株蛋白酶高产菌种 PE11。通过菌体形态观察、生理生化实验和 16S rDNA 鉴定，菌株PE11 被鉴定为解淀粉芽孢杆菌。通过筛选菌株 PE11 产蛋白酶的碳源和氮源，优选可溶性淀粉和牛肉膏分别为最佳的碳源和氮源。通过考察环境条件对菌株PE11 产蛋白酶的影响，以及分析产酶时间曲线，确定了菌株 PE11 产蛋白酶的最佳条件为：温度 30 C、初始 pH7.0、转速 200 rpm 和时间 36 h。在最佳的产酶条件下，发酵液中的蛋白酶活力可达 376 U/mL。菌种 PE1 具有较强的生产应用的潜力，但仍需进一步提高其产酶量，以及研究所产蛋白酶的酶学性质。