亚油酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒固定化.DOC

1、第集 海 洋 科 学 集 刊 No.49 2008 年月 STUDIA MARINA SINICA Aug,2008 亚油酸 修饰 羧甲基壳聚糖纳米 粒 固定化 菠萝蛋白酶的研究 * 谭玉龙，刘晨光，刘成圣，于乐军 （ 中国海洋大学 海洋生命学院 ， 青岛 266003） 酶的固定化技术有很多优点，它可以显著提高酶的活力和稳定性，使酶可以在极端的pH和温度下进行反应。不同的剂型已应用于酶的固定化，比如薄膜（ Tanioka et al. 1998, Arica 2000），微球（ Wu et al. 2005），纳米 粒 （ Akiyoshi et al. 1998, Li et al. 20

2、03, Tang et al. 2007）等。最近，纳 米材料因为其特别的性质与广泛的应用已越来越多地引起人们的关注，纳米胶束和纳米 粒 已被用于固定化酶。 由 聚乙二醇 -聚天冬氨酸嵌段共聚物制备的纳米胶束可用来包埋酶分子（溶菌酶、胰蛋白酶） （ Harada et al., 1998, 2001, Yuan et al. 2005） 。 Sunamoto的研究小组（ Akiyoshi et al. 1998）曾合成了普鲁兰糖的 胆甾烯基 衍生物，可在水中自聚集成凝胶纳米粒，并可与胰岛素等药物形成稳定的复合物。在以 往 的研究中发现胰蛋白酶可负载于纳米粒上 （ Liu et al. 2005

3、） ， 这与氯键 疏水作用力以及离子相互作用 有关 。 但 固定化酶的性质（比如稳定性、动力学常数等）还需要进一步研究。 本文作者 采用亚油酸修饰羧甲基壳聚糖，通过超声的方法制备凝胶纳米粒。选择菠萝蛋白酶应用于实验 因为其在动物炎症及人类 炎性肠病 等方面都有积极的治疗作用。酪蛋白作为酶 解 反应的底物。 将菠萝蛋白酶固定于 纳米粒上。探讨了影响固定化酶活力的因素（包括温度、储存稳定性等）。结果表明，酶被固定化后，热稳定性及储存稳定性均有提高。固定化酶的 Km值小于自由酶，表明固定化可以提高酶的稳定性并加强酶与底物的亲和力。 一、 材料及 方 法 1. 化学试剂 壳聚糖（低分子量），亚油酸 （

4、 LA） ， 1乙基 3（ 3二甲基氨丙基）碳二亚胺 （ EDC），菠萝蛋白酶均购于 Sigma公司。其他试剂都采用分析纯。 2. 制备 方法 （ 1） 制备 羧甲基壳聚糖（ CMCS） Na型羧甲基壳聚糖的制备： 称取 5g壳聚糖于三口烧瓶中，加入 100ml水 /异丙醇（ v/v=1/1） ， 搅拌 ， 使其溶胀 。 加入 6.75g NaOH， 50搅拌 1h。让壳聚糖在碱性条件下膨胀 , 形成碱化中心 。 将 7.5g氯乙酸溶于 10ml异丙醇，溶解后加到分液漏斗，向三口烧瓶中滴加，控制滴加时间 30min, 50搅拌 4h。 反应结束后 ， 布氏漏斗抽滤 ， 70%、 80%、 90

5、%乙醇水溶液、无水乙醇洗涤。所得产品放入 60烘箱烘干 , 即得白色粉状羧甲基壳聚糖（ Na型）。 H型羧甲基壳聚糖的制备： 称取 2.5g Na型羧甲基壳聚糖，加入 100ml 80%乙醇水溶液，搅拌。再加入 10ml 37% HCl溶液 ，搅拌 30min。布氏漏斗抽滤 ， 70%、 80%、 90%乙醇水溶液、无水乙醇洗涤。所得产品放入 60烘箱烘干 ,即得白色粉状羧甲基壳聚糖（ H型）。 * 本课题为 山东省优秀中青年科学家科研奖励基金 资助 （ 2006 03044） 。 通讯作者 ：刘晨光 副教授 传真： 86+532+82932586。 E-mail: 。 第一作者：谭玉龙 硕士

6、研究生 。 收稿日期： 2007 年月日。 海 洋 科 学 集 刊 2 （ 2） 制备 亚油酸羧甲基壳聚糖（ LA-CMCS） 首先 取 1g羧甲基 壳 聚糖溶解于 100ml 1%的 醋酸溶液 (pH4.6)中，然后 分别取 1ml、 1.5ml、2ml 亚油酸溶于 100ml 甲醇 中 。将两溶液混合，加 1mlEDC，搅拌 24h后， 加入 200ml甲醇 /氨水（体积比 为 7： 3），搅拌， 5000rpm/s， 离心 30min，去除上清。将沉淀分别用甲醇洗两次，乙醚洗一次，每次洗涤后都 要进行 5000rpm/s， 离心 30min，去除上清。 室温真空干燥 24h。 （ 3）

7、制备负载菠萝蛋白酶的 LA-CMCS 纳米粒 10mg LA-CMCS 悬浮于 10ml PBS 缓冲液 (pH7.4)。冰浴中 用 探头超声 (Utralsonic homogenizer UH-600)，超声重复两次得到澄清透明溶液 (20W，工作 10S， 停 2s)。加入 不同浓度的 菠萝蛋白酶 溶液 ，然后再 分别 超声两次。 （ 4） 载药量和 包封率 将不同浓度的菠萝蛋白酶溶液加到 1ml 0.2mg/ml的纳米粒溶液中 ， 浓度从 0.05mg/ml到 0.4mg/ml。将混合液超声，然后超滤，得到固定化酶。通过检测未固定化的酶含量来计算纳米粒对酶的的负载量与 包封 率。 载药

8、量 =（ A-B） /C 100 包封 率 =（ A-B） /A 100 A为 加入的菠萝蛋白酶含量； B为 超滤后 未固定化的菠萝蛋白酶含量； C为 冷冻干燥后的纳米粒质量 。 （ 5） 测定自由酶和固定化酶的酶 活力 取 2ml酶液加入试管中 ,然后加入 1%的酪蛋白溶液 3ml,准确保温 37反应 10min,再加入5ml三氯乙酸以终止反应 , 摇匀。 空白试样 ,方法同上 ,仅在加酪蛋白溶液之前 ,先加入 5ml三氯乙酸使酶失活 ,再加入酪蛋白溶液。 以空白样做对照 ,用分光光度计 280nm波长测定试样的吸光度 (O.D)。结果取三次测定的平均值。 （ 6） 菠萝蛋白酶活力单位 将

9、一个酶活力单位在 标准 实验条件下 (pH7.4， 37 时，反应 10min） ， 1min内 水解酪蛋白产生 1mg溶于三氯乙酸的酪氨酸时所需要的酶量。 二、 结果与讨论 1. 纳米粒表征 亚油酸通过 EDC共价连接于羧甲基壳聚糖的氨基上（图 1）。红外 谱 图 及 核磁共振 谱图表明， 共价 连接成功 。平均粒径与粒径分布通过动态激光光散射仪来分析，平均粒径约为417.8 17.8 nm (Liu et al. 2007)。 透射电子显微镜照片显示纳米粒有完整的圆形结构（图 2） 。 2. 纳米粒的载药量与 包封率 纳米粒 对 菠萝蛋白酶的负载量与 包封 率如表 1所示，一方面，随加入酶

10、的浓度的增加，从 0.05 到 0.3mg/ml，纳米粒的 包封 率逐渐下降；另一方面，酶的负载量却从 20.68 0.37%增加到 94.19 1.12%。但是，当浓度到达 0.4mg/ml时， 负载量却没 有 显著增加，表明纳米粒负载 菠萝蛋白酶 约 0.3mg/ml时达到饱和。 3. 温度对酶活力的影响 在 20 80下测定自由酶与固定化酶的活力 （ 图 3） ， 其最 适温度 相同 ，固定化 酶的最适温度（ 60 ） 也未改变 。 热稳定性是固定化酶的一个重要指标， 将固定 化 酶和自由酶保存于 0.05mol/L的 PBS缓冲 谭玉龙等：亚油酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒固定化菠萝蛋白酶的

11、研究 3 OOH ON H 2OO C H 2 C O O HOH ON HO HOn图 1 亚油酸羧甲基壳聚糖的结构图 表 1 载药量和包封率 菠萝蛋白酶 (mg/ml) 包封率 (%) 载药量 (%) 0.05 82.72 1.47 20.68 0.37 0.1 71.57 1.32 35.79 0.66 0.2 64.83 1.69 64.83 1.69 0.3 62.79 0.75 94.19 1.12 0.4 49.28 0.49 98.55 0.98 图 2 纳米粒的透射电镜照片 液 (pH7.4)中 ，在不同温度下保存 1h，迅速冷却测其酶活力。 在不同温度下保存后的相对酶活力

12、，随着温度升高，相对酶 活力 均 有所下降 （ 图 4） 。 从图中看出 固定化酶的热失活曲线比自由酶要低 。在 90 保存 1h后，固定化酶保持了 19%的相对 活力 ，而自由酶在同样的实验条件下，几乎丧失了全部 活力 。固定化酶热稳定性的提高是因为酶和纳米粒之间的多重的作用（比如 离子相互 作用、氢键结合以及疏水作用力等）。有 一 部分菠萝蛋白酶 被包裹于 纳米粒 内部，这可以保护酶的结构使其免受高温的破坏。纳米粒 可以预防蛋白质不可逆的变性聚海 洋 科 学 集 刊 4 集 ，其机制类似于分子伴侣的作用 (Akiyoshi et al. 1999, Takehiro et al. 1994

13、, Nomura et al. 2003) 。不论 是从结构上还是从酶 活力 上，纳米粒均可显著提高酶分子 抵御变性的能力和热稳定性 ，所以其可作为有效的酶固定化材料 (Bryjak et al., 1998, Hsieh et al. 2000, Karim et al., 2002, Li et al. 2003, Wu et al. 2005, Tu et al. 2006) 。 0204060801000 20 40 60 80 100温度()相对酶活力（%）自由酶固定化酶图 3 温度对酶活力的影响 02040608010020 30 40 50 60 70 80 90温度（）相对酶活

14、力（%）自由酶固定化酶图 4 自由酶和固定化酶的热稳定性 4. 储存稳定性 在无底物存在的情况下，将固定酶和自由酶在 70下分别保存 20 min 120 min, 迅速冷 却后 , 测其活力 (图 5)，固定化酶的稳定性曲线比自由酶要高，表明固定化酶的稳定性有显著地提高。 5. Km 米氏常数 Km是酶的一个重要参数，它的物理意义就是催化反应速度达到最大速度一半时的底物浓度。 Km一般用来检验酶与底物形成复合物的亲和能力 。 自由酶和固定化酶的米氏常谭玉龙等：亚油酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒固定化菠萝蛋白酶的研究 5 数的测定 (图 6),纳米粒固定酶后，对酶与底物之间的结合影响很小。固定化酶的

15、 Km为 0.36，比自由酶的 0.68略低，表明固定化酶加强了酶与底物的亲和力。原因可能是固定化过程对酶的构象有影响，以及纳米粒与酪蛋白之间的电荷作用或疏水作用也加强了酶对底 物的亲和力。 其机制还需要进一步研究。这一结果也与 Tang等 (2007)的研究结果一致，这使其在将来的应用性上更有吸引力 (Tang et al. 2007) 。 02040608010020 40 60 80 100 120时间（分）相对酶活力（%）自由酶固定化酶图 5 自由酶和固定化酶的储存稳定性 -10123456-10 0 10 20 30 401/s (ml/mg)1/v100(ml/u)自由酶固定化酶图

16、 6 自由酶和固定化酶的 Line-weaver Burk 曲线 海 洋 科 学 集 刊 6 参 考 文 献 Akiyoshi, K. , Kobayashi, S. , Shichibe, S. , et al.1998. Self-assembled hydrogel nanoparticle of cholesterol-bearing pullulan as a carrier of protein drugs: Complexation and stabilization of insulin, J. Control. Release, 54: 313320 Akiyoshi, K.

17、 , Sasaki, Y. , Sunamoto, J. . 1999. Molecular chaperone-like activity of hydrogel nanoparticles of hydrophobized pullulan: thermal stabilization with refolding of carbonic anhydrase B, Bioconjugate Chem. , 10: 321 324 Arica, M. Y. . 2000. Epoxy-derived pHEMA membrane for use bioactive macromolecule

18、s immobilization: Covalently bound urease in a continuous model system, J. Appl. Polym. Sci. , 77:2000 2008 Bryjak, J. , Kolarz, B. N. 1998. Immobilization of trypsin on acrylic copolymers, Process Biochem. , 33: 409417 Harada, A. , Kataoka, K. 1998. Novel polyion complex micelles entrapping enzyme

19、molecules in the core: Preparation of narrowlydistributed micelles from lysozyme and poly (ethylene glycol)-poly (aspartic acid) block copolymer in aqueous medium, Macromolecules, 31: 288 294 Harada, A. , Kataoka, K. . 2001. Pronounced activity of enzymes through the incorporation into the core of p

20、olyion complex micelles made from charged block copolymers, J. Control. Release, 72: 85 91 Hsieh, H. J. , Liu, P. C. , Liao, W. J. 2000. Immobilization of invertase via carbohydrate moiety on chitosan to enhance its thermal stability, Biotechnol. Lett. , 22: 1459 1464 Karim, M. R. , Hashinaga, F. 20

21、02. Preparation and properties of immobilized pummelo limonoid glucosyltransferase, Process Biochem. , 38: 809 814 Li, J. , Wang, J. Q. , Gavalas, V. G. , et al. .2003. Alumina-Pepsin Hybrid Nanoparticles with Orientation-Specific Enzyme Coupling, NANO Lett. , 3, 55 58 Liu, C. G. , Chen, X. G. , Par

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23、iamycin (ADR), Curr. Appl. Phys. , 7S1 e125 e129 Nomura, Y. , Ikeda, M. , Masahiro, I. , et al. 2003.Protein refolding assisted by self-assembled nanogels as novel artificicial molecular chaperone, Febs Lett. , 553: 271 276 Takehiro, N. , Kazunari, A. , Junzo, S. . 1994.Supramolecular Assembly betwe

24、en Nanoparticles of Hydrophobized Polysaccharide and Soluble Protein Complexation between the Self-Aggregate of Cholesterol-Bearing Pullulan and -Chymotrypsin, Macromolecules, 27: 7654 7659 Tang, Z. X. , Qian, J. Q. , Shi, L. E. , 2007, Characterizations of immobilized neutral lipase on chitosan nan

25、o-particles, Mater. Lett. , 61: 37-40. Tanioka, A. , Yokoyama, Y. , Miyasaka, K. 1998.Preparation and properties of enzyme- immobilized porous polypropylene films, J. Colloid Interf. Sci. , 200:185 187 Tu, M. B. , Zhang, X. , Kurabi, A. , et al. . 2006. Immobilization of -glucosidase on Eupergit C f

26、or lignocellulose hydrolysis, Biotechno. Lett. , 28: 151 156 Wu, S. G. , Liu, B. L. , Li, S. J. 2005. Behaviors of enzyme immobilization onto functional microspheres, Int. J. Biol. Macromol. , 37: 263 267 Yodoya, S. , Takagi, T. , Kurotani, M. , et al. . 2003.Immobilization of bromelain onto porous

27、copoly ( -methyl-L-glutamate/L-leucine) beads, Eur. Polym. J. , 39: 173 180 Yuan, X. , Yamasaki, Y. , Harada, A. , et al. .2005.Characterization of stable lysozyme-entrapped polyion complex (PIC) micelles with crosslinked core by glutaraldehyde, Polymer, 46: 7749 7758 谭玉龙等：亚油酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒固定化菠萝蛋白酶的研究

28、7 STUD ON LINOLEIC ACID MODIFIED CARBOXYMEHYL CHITOSAN NANOPARTICLES FIXATION BROMELAIN TAN Yulong LIU Chenguang LIU Chengheng YU Lejun (College of Marine Life Sciences,Ocean University of China,Qindao 266003) ABSTRACT Hydrogel nanoparticles can be prepared by using linoleic acid (LA) modified carbo

29、xymethyl chitosan (CMCS) after sonication. Bromelain can be loaded onto nanoparticles of LA-CMCS. Factors affecting the activity of the immobilized enzyme, including temperature, storage etc., were investigated in this study. The results showed that the stability of bromelain for heat and storage was improved after immobilization on nanoparticles. The Michaelis constant (Km) of the immobilized enzyme, was smaller than that of free enzyme which indicated that the immobilization could promote the stability of the enzyme and strengthen the affinity of the enzyme for the substrate.