3种经典工艺生产的金银花提取物中糖类成分含量比较.doc

1、3 种经典工艺生产的金银花提取物中糖类成分含量比较作者：陈有根 张蓉 邬国庆 王志斌【摘要】 ：目的 比较 3 种经典工艺生产的金银花提取物中果糖、葡萄糖、蔗糖和总糖的含量差异,为指导含金银花中成药的生产和质量控制提供科学依据。方法 用经典的水-醇法、石-硫法和改良石-硫法生产金银花提取物样品,用高效液相-梯度洗脱法测定 3 种提取物样品中果糖、葡萄糖和蔗糖含量,用分光光度法测定 3 种提取物样品中总糖含量。结果 3 种提取物中果糖含量分别为 5.44%、3.47%、4.74%,葡萄糖含量分别为4.35%、2.73%、4.21%,蔗糖含量分别为 17.41%、8.47%、14.47%,总糖含量

2、分别为 50.63%、41.12%、35.90%。结论 测定了金银花提取物中除绿原酸类以外的 36%51%总成分含量,并揭示了其中 19%27%的化学成分组成为果糖、葡萄糖、蔗糖。 【关键词】 金银花提取物 果糖 葡萄糖 蔗糖Abstract：Objective To determine the contents of fructose, glucose, sucrose and total saccharide in honeysuckle extracts which were produced by three classical methods, to provide scientif

3、ic data for producing and controlling of those patent medicines containing honeysuckle extract. Methods Three classical extract methods were used for producing honeysuckle extracts. HPLC-ELSD method was used for determining the contents of fructose, glucose, sucrose, and a spectrophotometric determi

4、nation method was used for determining the contents of total saccharide. Results The contents of fructose in three honeysuckle extracts were 5.44%, 3.47%, 4.74%, glucose were 4.35%, 2.73%, 4.21%, glucose were 17.41%, 8.47%, 14.47%, and total saccharide were 50.63%, 41.12%, 35.90%, respectively. Conc

5、lusion About 36%51% of total components of honeysuckle extracts were determined except chlorogenic acids, and 19%27% of components in the extracts were fructose, glucose, sucrose.Key words：honeysuckle extract；fructose；glucose；sucroses金银花为常用中药,来源于忍冬科植物忍冬 Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾,具有清热解毒、凉散风热的功能。金

6、银花提取物是生产多种中成药制剂的中间原料。 中华人民共和国药典和卫生部药品标准中收载的金银花提取物的生产工艺有 3 种,即：水-醇法1、石-硫法2和改良石-硫法3,它们均属于有法定标准的工艺方法。用这 3种工艺生产的提取物分别作为双黄连、茵栀黄和银黄注射液的中间原料。这 3 种注射剂在临床都有十余年的使用历史,其疗效得到众多临床医生和患者的肯定。关于金银花提取物的质量控制报道较多,多数以绿原酸含量作为控制指标,未见用糖类成分作为指标对金银花提取物进行质量控制研究的报道。本试验采用 RP-HPLC-ELSD 法测定了 3 种经典工艺生产的金银花提取物中果糖、葡萄糖和蔗糖含量,本研究可为含金银花中

7、药注射剂的生产和质量控制提供具有实用价值的实验数据。1 仪器与试药Agilent-1100 高效液相色谱仪,四元泵,自动进样器,柱温箱,Alltech ELSD2000ES 检测器,Agilent A10.02 工作站。岛津 UV-2450 PC型可见-紫外分光光度仪。果糖、葡萄糖和蔗糖对照品(中国药品生物制品检定所提供)；金银花药材(采自山东省平邑县白彦镇)。乙腈为色谱纯,水为去离子水,其它试剂均为分析纯,苯酚重蒸后用水配成 5%的溶液。2 方法与结果2.1 果糖、葡萄糖和蔗糖的含量测定2.1.1 色谱条件 色谱柱：Inertsil-NH2(4.6 mm250 mm, 5 m)；流动相：乙腈

8、-水(7822)；流速：1 mL/min；柱温：30 ；ELSD 检测器氮气流速2.2 L/min,漂移管温度 85 。2.1.2 供试品溶液的制备 取金银花提取物 A、B、C 细粉 300 mg(3 种提取物样品的制备方法见文献4),精密称定,分别置 50 mL 量瓶中,加 70%乙醇至刻度,超声(600 W)处理 10 min, 0.45 m 微孔滤膜滤过,取续滤液,备用。2.1.3 线性关系考察 分别精密称取果糖、葡萄糖和蔗糖适量,加 70%乙醇制成每 1 mL 含果糖 1.484 mg、葡萄糖 1.456 mg 和蔗糖 2.648 mg 的混合对照品溶液。精密吸取 0.5、1.0、2.

9、0、3.0、4.0、5.0 mL,置 10 mL 量瓶中,加 70%乙醇至刻度,摇匀,制成系列混合对照品溶液。按上述色谱条件分别进样 10 L,以进样量的自然对数(ln m)为横坐标,峰面积的自然对数(ln A)为纵坐标,计算,得果糖的回归方程为：ln A1.308 6ln m7.946 4,r0.999 6,线性范围为 0.7287.280 g；葡萄糖的回归方程为：ln A1.277 1ln m7.979 3,r0.999 6,线性范围为 0.7427.420 g；蔗糖的回归方程为：ln A1.257 7ln m7.982 6,r0.999 9,线性范围为 1.32413.420 g。2.1

10、.4 系统适应性 在上述色谱条件下测定,结果表明,理论塔板数以果糖峰计算为 12 745,以葡萄糖峰计算为 5 578,以蔗糖峰计算为 13 425(见图 1)。2.1.5 精密度试验 取果糖、葡萄糖和蔗糖质量浓度分别为 0.296 8、0.291 2 和0.794 4 mg/mL 的混合对照品溶液,连续进样 5 次,每次 10 L,以果糖、葡萄糖和蔗糖的峰面积计算进样精密度,RSD 分别为 1.62%、1.59%和1.50%。2.1.6 重复性试验 取提取物 C,按供试品溶液制备方法制备 5 份供试液,依法测定,计算,得果糖平均含量为 4.74%(RSD1.43%),葡萄糖平均含量为4.21

11、%(RSD1.52%),蔗糖平均含量为 14.47%(RSD1.49%)。2.1.7 稳定性试验 取同一份供试品溶液,每隔 2 h 进样测定,结果 5 次测定的果糖、葡萄糖和蔗糖的峰面积基本不变,RSD 分别为 1.03%、1.12%、1.46%,表明供试品溶液在 8 h 内稳定。2.1.8 加样回收率试验 取已测定含量的提取物 C 细粉 150 mg,5 份,精密称定,分别置 50 mL 量瓶中,精密加入果糖、葡萄糖和蔗糖质量浓度分别为 0.296 8、0.291 2 和 0.794 4 mg/mL 的混合对照品溶液 25 mL,再加 70%乙醇至刻度,超声(600 W)处理 10 min,

12、0.45 m 微孔滤膜滤过,依法测定,计算回收率,结果见表 1表 3。表 1 果糖加样回收率试验结果(略) 表 2 葡萄糖加样回收率试验结果(略)表 3 蔗糖加样回收率试验结果(略)2.1.9 样品测定 取上述 3 种金银花提取物,按“2.1.2”项下操作制备供试品溶液,各 3 份,按上述色谱条件测定果糖、葡萄糖、蔗糖的含量,结果见表 4。表4 样品含量测定结果(略)2.2 总糖含量测定2.2.1 供试品溶液的制备 取金银花提取物细粉 100 mg,精密称定,置 50 mL 量瓶中,加水至刻度,超声处理 10 min,取出,冷却至室温,精密吸取 1 mL,置 25 mL 量瓶中,加水至刻度,摇

13、匀,即得。2.2.2 检测波长的确定取显色后的对照品和供试品溶液,在 400700 nm 波长范围内进行扫描,结果表明,对照品溶液和供试品仅在 490 nm 处有 1 个吸收峰,因此,选择 490 nm 作为检测波长。2.2.3 线性关系考察 精密称取无水葡萄糖对照品,加水使溶解制成每 1 mL 含无水葡萄糖 0.044 6 mg 的对照品溶液。分别精密量取对照品溶液 2、4、6、8、10 mL,置 10 mL 量瓶中,加水至刻度,摇匀,制得系列对照品溶液。分别精密吸取系列对照品溶液 2 mL 于具塞试管中,加 5%苯酚试液 1.0 mL,混匀,迅速加 5.0 mL 浓硫酸,密塞,摇匀,置沸水

14、浴加热 15 min,取出,迅速置冰水中冷却,以 5%的苯酚-硫酸溶液为空白,于 490 nm 处测定吸收值。以对照品浓度(C)为横坐标,吸收度(A)为纵坐标,计算回归方程为：A14.589C0.1311,r0.999 2(n3)。结果表明,葡萄糖在8.9244.60 g/mL 浓度范围内具有良好的线性关系。2.2.4 精密度试验取金银花提取物 C 细粉 100 mg,精密称定,置 50 mL 量瓶中,加水至刻度,超声处理 10 min,取出,冷却至室温,精密吸取 1 mL,置 25 mL 量瓶中,加水至刻度,摇匀,精密吸取 2 mL,5 份,依法显色,测定吸收值,结果RSD0.27%。2.2

15、.5 重复性试验 取金银花提取物 C 细粉 100 mg,5 份,精密称定,分别置 50 mL 量瓶中,依法处理,显色,测定吸收值,计算,得总糖平均含量为35.90%(RSD1.32%)。2.2.6 显色稳定性试验 取同一份供试品溶液,测定时间-吸收值曲线,结果在 30 min 内吸收值基本不变,表明供试品溶液显色后在 30 min 内稳定。2.2.7 加样回收率试验 取金银花提取物 C 细粉 50 mg,5 份,精密称定,分别置 50 mL 量瓶中,分别精密加入无水葡萄糖对照品 30 mg,加水至刻度,依法处理,显色,测定吸收值,计算回收率,结果见表 5。表 5 总糖加样回收率试验结果(略)

16、2.2.8 样品测定 分别取金银花提取物细粉 100 mg,精密称定,置 50 mL 量瓶中,依法处理,显色,测定吸收值,计算含量,结果见表 6。表 6 总糖样品含量测定结果(略)3 讨论双黄连、茵栀黄和银黄注射液是目前国内使用最广的 3 种含金银花的中药注射剂,在临床都有十余年的使用历史,以其疗效好、起效快、给药方便而得到众多临床医生和患者的肯定。然而,近年来频频发生的危及患者生命安全的中药注射剂不良反应(其中含金银花的中药注射剂尤其突出),又使人们对中药注射剂的认识蒙上了一层面纱。因此,中药注射剂中功效成分以外的化学组分也成了此类制剂质量控制的关注焦点。我们曾经报道了上述 3 种金银花提取

17、物样品中的绿原酸、3,5-二咖啡酰基奎宁酸和总绿原酸的含量4,本实验分别用 HPLC 方法测定了这 3种提取物中除绿原酸类成分外 18%27%的化学组分,用分光光度法测定了其中除总绿原酸以外 36%51%的总成分含量,使我们对含金银花的中药注射剂的组分有了更明确的了解。本实验结果可为指导含金银花中药注射剂的生产以及质量控制提供具有实用价值的研究方法和实验数据,也可以为其它中药注射剂的质量控制提供可借鉴的方法。【参考文献】1 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)S.北京：化学工业出版社,2005.505.2 中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药品标准中药成方制剂(第十四册)S.1997.98.3 中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药品标准中药成方制剂(第十九册)S.1998.197.4 陈有根,王志斌,戴俊东.3 种经典工艺生产的金银花提取物中绿原酸类成分含量比较J.中成药,2007,29(3)：5759.