2 O2 处理大块牛松质骨后成分分析.doc

1、2 O2 处理大块牛松质骨后成分分析作者：罗卓荆 胡蕴玉 刘智广 【关键词】 骨移植 关键词: 骨移植;氨基酸分析;移植，异种 摘 要:目的 研究大块牛松质骨（MBCB）处理后的各种成分及高浓度 H2 O2 消除异种骨抗原性的机制. 方法 采用干燥失重法及残渣法检测经过系统去抗原处理后的大块异种骨的有机、无机质及水份含量;将 25块大块新鲜牛松质骨均分为 5 组，分别用高浓度 H2 O2 浸泡0，24，48，72 和 96h，采用氨基酸分析方法研究不同 H 2 O2 处理时间的骨块中羟脯氨酸、脯氨酸含量. 结果 经处理后，MBCB 为色白，并呈现出多孔样结构，扫描电镜观察，松质骨呈清晰的多孔结

2、构，孔壁光滑;5 组检测样品中羟脯氨酸及脯氨酸的含量随着 H2 O2 处理时间的延长均有同步下降的趋势，但各组间无显著性差异（P0.05）;5 组检测样品中 18 种氨基酸含量及氨基酸总量随着 H2 O 2 处理时间的延长亦有同步下降的趋势，仅 0h 与 96h 组间 18 种氨基酸以及总氨基酸含量有显著性差异（P0.05） ，其余各组间无显著性差异（P0.05）;5 组检测样品中羟脯氨酸及脯氨酸在总氨基酸总量所占比例随着 H2 O2 处理时间的延长无明显变化，各组间无显著性差异（P0.05）. 结论 大块异种骨经系统去抗原处理后，保持了一定的有机及无机质比例，既具有良好的力学特性又消除了其抗

3、原性，提示高氧化剂引起蛋白质变性是消除大块异种骨抗原性的主要原因. Keywords:bone transplantation;amino acid analysis;com-ponent，heterologous Abstract:AIM To analyse the components of antigen-elimi-nated massive bovine cancellous bone（MBCB）and to study the mechanism of high concn H2 O 2 eliminating the antigenici-ty of xenogenic bon

4、e.METHODS Dry-weight lost method was applied to measure the organic，mineral，and water com-ponents in MBCB;25massive flesh bovine cancellous bone blocks were distributed into5groups，which were dipped in300mLL-1 concn H2 O2 for0，24，48，72，96h.The quan-tities of hydroxyproline and proline in the five gr

5、oups were measured by amino acid analysis.RESULTS After the anti-gen eliminating program，MBCB occurred as white colour and porous structure.SEM showed the wall of bone trabecula in the center part of MBCB was quite clear.The quantities of hydroxyproline and proline decreased a little with the time t

6、reated in high concn H 2 O2 in the five groups，but no differ-ences between the five groups were found;the same decreas-ing tendency was found to the quantities of18amino acids of the bone blocks in the five groups;difference was only found between0h and96h group（P0.05）.The percent of hy-droxyproline

7、 and proline in amino acids was not found any difference in the five groups（P0.05）.CONCLUSION The MBCB may contain reasonable rate of organic and miner-al material，which is beneficial to keeping the mechanic prop-erty of MBCB after its antigen-eliminating program.Denatu-ralization of protein in the

8、condition of oxidation of high con-cn H2 O2 would be the major mechanism to eliminate the anti-genicity of massive xenogenic bone. 0 引言 在以往颗粒型异种松质骨处理与应用的基础上1 ，为了更广泛地应用大块异种骨修复四肢大节段骨缺损，我们对高浓度 H2 O 2 去抗原处理异种骨的机制进行研究，同时对异种骨经去抗原处理后的成分进行分析，为异种骨块的临床应用提供实验基础. 1 材料和方法 1.1 材料 新鲜牛肱骨上端松质骨. 1.2 方法 大块去抗原牛松质骨（anti

9、gen-extracted massive bovine cancellous bone，MBCB）选取新鲜牛肱骨上端松质骨，截取15mm20mm30mm 形状规则长方体骨块，用 50压力水反复冲洗，沥干;50下 11 氯仿甲醇脱脂 24h;50下 300mLL-1 H2 O2 浸泡24h;重复步骤 2 次，脱脂共 24h3，H2 O2 处理 24h3;双蒸水透析12h2;0.3molL-1 的 HCl 内脱钙处理 5min，双蒸水反复冲洗至pH6.0;冷冻干燥，密封包装. 1.2.1 MBCB 的扫描电镜 SEM 观察 4mm 大小的电镜样品分别取材于新鲜牛松质骨及 MBCB，多聚甲醛固定，

10、锇酸及乙晴处理，真空镀膜，扫描电镜观察. 1.2.2 MBCB 的成分检测 参照中华人民共和国药典1995 版，干燥失重法及残渣法.检测步骤:取相同小坩锅 4 个，置 80烘烤 24h，蒸发坩锅内水分;选取密封的MBCB 冻干骨 4 块，编号 A，B，C，D，分别准确称质量（m） ，再分别放入坩锅内称质量（m1）;将 MBCB 及坩锅同置于 110烘烤 24h，干燥塔内凉至室温后称质量（m2）;将块型牛松质骨载体及坩锅再置于马佛电阻炉内，800灼炽 7h，干燥塔内凉至室温后准确称质量（m3）;计算方法含水量 mwater =m1-m2，含有机质 morganic =m2-m3，含无机质 m m

11、ineral =m3-（m1-m）. 1.2.3 MBCB 的氨基酸分析 将 25 块新鲜牛肱骨松质骨块经水洗、脱脂后分为 5 组，各组 5 枚骨块，分别置于 50300mLL-1 H2 O 2 溶液中 0，24，48，72 和96h 进行浸泡处理，将处理后的异种骨块进行氨基酸检测分析.将上述各组样品均置于 80下烘干 24h，在干燥室内冷却至室温后准确称取20mg，放于消化管中;加入 6molL-1 HCl 共 3mL，立即旋紧管盖，置 110下酸水解 22h;将酸水解液倒入蝶型坩锅内，于 100水浴挥发盐酸，再加入少量蒸溜水，蒸干共 3 次;用适量 pH2.2 柠檬酸钠缓冲液溶解，使其终浓

12、度为干骨样品 20gL-1 ;12589g 离心 15min，取上清液备用，做羟脯氨酸、脯氨酸及氨基酸总量定量分析.羟脯氨酸、脯氨酸测定:Beckman121MB 型氨基酸分析仪，分析程序为自编胶原特异性氨基酸分析程序2 ;填充树脂为 Beckman AA10 型，柱床 10cm，pH2.20，配制pH3.0 柠檬酸钠缓冲液和茚三酮试剂3 ，600molL-1 羟脯氨酸、脯氨酸标准液（上海华美生物工程公司）用 pH2.20 缓冲液配制;柱温 46恒温;上样量 50L;缓冲液流速 10mLh-1 ，茚三酮流速 5mLh-1 ;检测波长 440nm，数据处理系统为 HP-3394A 积分仪.骨样品

13、中羟脯氨酸、脯氨酸含量用下式计算1，4 Cs=S 样品 氨基酸标准液浓度样品稀释倍数氨基酸分子质量 S 标准 1000 Cs干骨羟脯氨酸或脯氨酸含量（mgg 样品 标准液中羟脯氨酸或脯氨酸波峰面积;S 标准 样品液中羟脯氨酸或脯氨酸波峰面积. 采用方差分析方法处理实验数据，比较 H2 O2 不同浸泡处理时间的各组中羟脯氨酸、脯氨酸含量. 氨基酸总量的测定:紫外/可见光分光光度计（Beckman DU-60） ，氨基酸标准液（Beckman 公司，内含 18 种氨基酸，每种氨基酸浓度为100molL-1 ，氨基酸终浓度 1800molL-1 ） ，分别准确吸取各组骨水解液 10L、氨基酸标准液

14、20L、空白对照之双蒸水20L，用双蒸水补足定容至 2mL，加入茚三酮试剂 2mL，置 100水浴5min，流水冷却至室温，测吸光度，检测波长为 570nm.在波长 570nm 条件下，骨样品中羟脯氨酸及脯氨酸吸光度极低，故骨样品中总氨基酸含量 Cs 总 由 18 种氨基酸含量 Cs18 加上由 440nm 检测的羟脯氨酸 Cs 羟脯 及脯氨酸 Cs 脯 含量组成.Cs 18 用以下公式计算 Cs18 =A 样品 18 种氨基酸标准液浓度稀释倍数18 种氨基酸平均分子质量 A 标准 Cs18 骨样品中 18 种氨基酸含量（mgg-1 ）;A 样品 样品液中吸光度;A 标准 标准液中吸光度.氨基

15、酸总量 Cs 总 =Cs 18 +Cs 羟脯 +Cs 脯 2 结果 2.1 MBCB 的大体及 SEM 观察 MBCB 经系列化学处理后，色白，并呈现出多孔样结构，具有一定的韧性及坚硬度.新鲜牛松质骨扫描电镜观察，未显示出多孔隙结构，孔隙被骨髓及油脂等充满;MBCB 扫描电镜观察，松质骨呈清晰的多孔结构，孔壁光 滑（Fig1（略） ）. 2.2 MBCB 成分检测结果 MBCB 中水分、无机质、有机质质量分数见 Tab1.w（水）=m 水m=65.61392.0100%=4.7%; w（有机质）=m 有 m=666.71392.0100%=47.9%;w（无机质）=m 无 m=659.7 13

16、92.0100%=47.4%.表 1 MBCB 中水分、无机质、有机质质量分数（略） 2.3 H 2 O 2 处理异种骨的氨基酸分析 5 组检测样品中羟脯氨酸及脯氨酸的含量随着 H2 O 2 处理时间延长均有同步下降的趋势，但变化程度并不明显，各组间无显著性差异（P0.05，Tab2）.骨样品中 18 种氨基酸及总氨基酸含量随着 H2 O2 处理时间的延长均有同步下降趋势，但变化并不明显，仅 0h 与 96h 组间18 种氨基酸以及总氨基酸含量有显著性差异（P0.05，Tab3） ，其余各组间无显著性差异（P0.05）.5 组检测样品中羟脯氨酸及脯氨酸在总氨基酸总量中所占比例随着 H 2 O2

17、 处理时间的延长无明显变化，各组间无显著性差异（P0.05，Tab4）.表 2 骨样品中羟脯氨酸、脯氨酸质量分数（略） 表 3 骨样品中氨基酸质量分数 表 4 氨基酸中羟脯氨酸、脯氨酸质量分数（略） 3 讨论 松质骨由骨小梁及骨小梁间的骨髓成分构成，骨髓内包含大量的各种血细胞以及血管、神经、脂肪等组织，骨髓将骨小梁间隙填充，在扫描电镜下未能见 到松质骨的多孔样结构.异种骨抗原分布研究资料表明，骨中的主要抗原成分集中于骨细胞、成骨细胞、软骨细胞以及骨髓细胞、血浆等 5 .在本实验中，反复采用 50压力水冲洗，使松质骨中细胞低渗裂解，氯仿甲醇脱脂清除骨小梁间的大量脂肪组织，以高浓度 H2 O2 浸

18、泡处理，二者交替进行，结合离心处理，将牛松质骨内的脂肪、细胞及残片均有效清除.处理后的牛松质骨在 SEM 观察下显示清晰的多孔结构，孔壁干净、光滑，未见其他物质残留，彻底清除异种骨中的主要抗原物质，为骨生长因子的复合及新骨的长入提供理想的微环境4 . 正常成熟骨中含水质量分数为 20%25%、有机质 40%和无机盐 60%，无机盐决定骨的强度，而有机质决定骨的弹性和韧性.本实验中冻干 MBCB的成分检测结果表明，MBCB 的水分残留质量分数低于 5%，而胶原等有机质和无机骨矿各占 47%左右，由于保持了合理的有机及无机质比例，故也保持 MBCB 一定的韧性和强度6 . 成熟骨的有机质中大约 9

19、0%为胶原，其余为氨基多糖、其他蛋白质、肽类及脂类.骨基质中的胶原主要是型胶原，由两条 1 肽链和一条2 肽链相互拧成的三联螺旋结构. 肽链组成有以下两个主要特点 肽链的氨基酸排列顺序中，每隔两个其他氨基酸残基就有一个甘氨酸; 肽链中含有其他蛋白质中含量极少的羟脯氨酸与羟赖氨酸，脯氨酸及赖氨酸的含量也较多，羟脯氨酸与脯氨酸残基是维持原胶原分子三联螺旋构型的重要组成部分.在型胶原 肽链的 1000 个氨基酸残基中，甘氨酸约占 330 个，脯氨酸约占 129 个，羟脯氨酸约占 96 个，赖氨酸约占 30 个，羟赖氨酸约占 4 个.不同组织中的胶原所含羟脯氨酸及羟赖氨酸残基差很大，因此，检测骨基质中

20、羟脯氨酸及脯氨酸含量，可特异地反应骨基质有机质中包括胶原蛋白在内的各种组成成分的变化. 以往认为，高浓度 H2 O2 处理异种骨，其消除抗原性的原理在于清除骨基质中抗原性较强的蛋白成分，即脱蛋白过程.我们发现，骨基质中的氨基酸总量随着 H2 O2 处理的时间延长并无明显的降低，而羟脯氨酸及脯氨酸在氨基酸总量中所占比例也未发生明显改变，没有表现出大量去除蛋白的现象.回顾以往的研究结果，牛松质骨在 H2 O2 浸渍时间越长，骨块机械强度损失越严重6 ，以及 H2 O2 处理时间越长，异种骨抗原性消除越彻底7 ，分析 H2 O2 消除异种骨抗原性的机制可能在于强氧化剂作用下发生的包括胶原蛋白在内的蛋

21、白质变性.胶原蛋白的变性影响骨块的生物力学特性，使得骨块的脆性增加，强度降低;而骨块内的抗原物质发生蛋白变性，使其抗原决定簇的构像改变，从而减弱或消除了其抗原性. 大块异种骨经系统的处理后，保持了一定的有机及无机质比例，既使其具有良好的力学特性又消除了其抗原性，本研究结果提示高氧化剂引起的蛋白质变 性是消除大块异种骨抗原性的主要原因. 参考文献: 1Liu W，Hu YY，Lu YP，Wang YQ.Experimental studies on re-constituted xenograft and its clinical application J.Zhonghua Waike Zaz

22、hi（Chin J Surg） ，1993;31（12）:709-712. 2Liu ZG，Ma HY.The study of the rapid method of measuring collagen characteristic amino acid J.Anjisuan Zazhi（Chin J Amino Acid） ，1994;16（3）:8-12. 3Liu ZG，Chen BF，Su CZ.The studies of the buffer and3-ke-tone indene reagent used in the amino acid analysis of hydro

23、lyze liquid of protein J.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ） ，1990;11（3）:218-219. 4Luo ZJ，Hu YY，Lu R，Yang G，Li XB，Li D，Zhu YS.The development of massive reconstituted bone xenograft and the ex-perimental study on osteoinductive activity in mice J .Zhonghua Shiyan Waike Zazhi（Chin J Exp Surg） ，1998;15（6）:530-532. 5Luo ZJ，Hu YY，Wang Q，Yang SJ.Immunohistochemical loca-tion of xenograft antigens in bovine cancellous bone J.Zhonghua Jiaoxing Waike Zazhi（Orthop J Chin） ，1998;5（6）:539-540.