TK自杀基因的构建及鉴定.doc

1、TK 自杀基因的构建及鉴定【摘要】 目的 利用分子生物学技术，构建胸苷激酶基因（TK）自杀基因并测定其结构，为该自杀基因的进一步研究提供良好的实验基础。方法 以人类单纯疱疹病毒 （HSV1） 基因组 DNA 为模板，利用聚合酶链反应（PCR）法，扩增出约为 1100 bp TK 基因，定向克隆到载体 PEGM-T，构建克隆载体。两端分别引入限制性内切酶 Not 、Xhol酶切位点，经 PCR 及酶切鉴定初步证实为重组体后，测序认证。结果 经 PCR、酶切鉴定和测序鉴定完成 TK 基因的构建，同源性高达 98.70%，完全具备表达该目的基因的要求。结论 成功扩增出 TK 基因，为继续研究打下基础

2、。 【关键词】 TK 基因 自杀基因 聚合酶链反应 Abstract： Objective To construct the suicide gene herpes simplex virus thymidine kinase gene (HSV-TK) and to sequence its structure for identification. Methods The TK gene fragment was amplified by PCR from the genome DNA of herpes simplex virus. The PCR product was cloned

3、to the vector PEGM-T. The interested TK gene fragment in the recombinant plasmid obtained was confirmed by PCR, enzyme digestion and sequencing. Results The TK gene was successfully obtained. The product was 98.70% original. Conclusion The construction of TK gene may help start the research into the

4、 suicide gene strategy for the control of cancers. Key words: thymidine kinase; suicide gene; polymerase chain reaction (PCR) 将某些细菌及病毒中特有的药物敏感基因转导入肿瘤细胞，使肿瘤细胞产生某些酶类，将原来无毒或低毒的前体药物代谢转化成细胞毒性产物而杀伤宿主细胞，这种使肿瘤细胞自杀的基因称为“自杀基因” 1 。肿瘤的自杀基因疗法首创于 1986 年，为目前研究的热点, 其中研究最多的当属单纯疱疹病毒胸苷激酶 HSV - TK 基因。本实验构建了 TK 基因，以期为进一

5、步研究自杀基因系统的抗肿瘤机制及各种肿瘤基因治疗作用打下基础。 1 材料和方法 1.1 材料 本实验克隆载体 PEGM-T 购自 Promega 公司；病毒株为人类单纯疱疹病毒（HSV1）作为 TK 基因模板抽提病毒，购自武汉中国病毒库；大肠杆菌 JM109 作为宿主菌，由徐州医学院病理学教研室提供。主要试剂盒和实验试剂：PCR 扩增试剂盒、DNA 胶回收试剂盒、限制性内切酶、T4DNA 连接酶为 Fermentas 公司产品，核酸分子标准品（DL1500 Marker） 、DNA marker (Lambda-pUC Mix Marker)为 Takara 公司产品，特异性引物 TK 基因引

6、物按照分子克隆实验指南引物设计原则，并且加入特定的酶切位点，由上海生工生物工程有限公司合成。 上游引物：P1 5-TAGCGGCCGCATGGCTTCGTACCCCTGCCATC-3 Not 下游引物：P2 5-GCCTCGAGGTTAGCCTCCCCCATCTC-3 Xhol 1.2 方法 1.2.1 HSV1 基因组 DNA 的抽提 HSV1 加入 50 ml LB 液，250 r/min 37摇菌过夜。上海生工生物工程有限公司基因组 DNA 分离纯化试剂盒用于提纯基因组 DNA（按操作说明书进行） 。 1.2.2 PCR 扩增目的基因片段 以 HSV1 基因组 DNA 为模板进行PCR

7、扩增。50 l PCR 反应体系中含 HSV1 基因组 DNA 模板 3.0 l，dNTP 2.0 mol/L 5 l， MgCl2 1.0 mol/L 2 l，引物各为 5 pmol，Tag 酶 0.5 l。反应参数：94 预变性 5 min 后，94 变性60 s，56 退火 90 s，72 延伸 75 s，35 个循环后，72 最终延伸20 min。 1.2.3 TK 基因的全序列测定 取含 TK 基因片段的 PCR 扩增产物 50 l，1%琼脂糖凝胶电泳分离纯化 TK 基因（1100 bp） 。取纯化产物 3 l 加入载体 PGEM-T 1 l ，在 T4DNA 连接酶作用下， 18

8、连接过夜，构建 PGEM-T-TK 重组质粒。取连接产物转化感受态细胞大肠杆菌 JM109 后，接种 Amp 抗性、IPTG、x-gal 琼脂培养皿，利用蓝白斑菌显色，挑选阳性重组子。取阳性克隆菌落，摇菌过夜，提纯质粒后，分别用 T 及 SP6 通用测序引物从两端测定基因全序列（委托上海生工生物工程有限公司测序） ，Omega 基因分析软件进行基因序列分析。 2 结 果 2.1 PCR 扩增结果 经 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定表明，TK 基因片段约为 1100 bp，扩增的片段大小与预计一致。见图 1。 图 1 TK 基因的 PCR 扩增图 M 为 Marker,TK 为编码胸苷激酶（TK）的基因

9、 2.2 重组质粒的酶切鉴定 重组质粒 PEGM-T-TK 经 Not、Xhol酶切，切出片段约分别为 1100 bp、3000 bp，与预计大小一致。见图2。 图 2 PFGM-T-TK 质粒酶切分析图 M 为 Marker,1 为 PEGM-T 载体（3000 bp）,2 为 TK 基因（1000 bp） 2.3 测序结果 分别用 T7 及 SP6 通用测序引物从两端测定基因全序列，以达到测通目的基因全部碱基序列的目的。利用 DNAStar 分析软件与 GenBank 提供的 TK 基因序列对比，同源性高达 98.70%。 3 讨 论 TK 基因是编码胸苷激酶的基因，病毒、细菌、真核细胞及

10、其线粒体内均存在 TK 基因。不同来源的 TK 基因结构及其蛋白产物的分子大小、理化性质和生化功能均不同。肿瘤基因治疗中，常用的有单纯疱疹病毒(HSV)和水痘带状疱疹病毒(VZV)的 TK 基因。 HSV1-TK/GCV 系统治疗恶性肿瘤是研究最广泛的自杀基因治疗方法之一。HSV 载体携带胸苷激酶基因（TK 基因） ，进入肿瘤细胞并表达 HSV-TK基因，HSV-TK 基因编码胸苷激酶活化后，使抗病毒药物丙氧鸟苷（GCV）三磷酸化，抑制癌细胞的 DNA 聚合酶活性；或代替 Dtp 渗入到细胞 DNA中，抑制 DNA 聚合酶并掺入 DNA 合成链中，引起链中止、染色体变性和姐妹染色单体交换，使癌

11、细胞的 DNA、蛋白质合成受到抑制，肿瘤细胞死亡，从而达到治疗癌症的目的。 因此， 细胞增殖越快， 则 GCV 对其作用越明显 。此外,由于 HSV-TK/GCV 存在旁观者效应而扩大对肿瘤细胞的杀伤效应。Kuriyama 等用 HSV-TK 基因转染肝癌细胞，不仅转染了 HSV-TK 基因的肝癌细胞大量死亡，而且周围大量未转染的肝癌细胞亦有大量死亡的现象，其机制可能与细胞间连接有关。HSV-TK/GCV 系统还可以通过诱导机体免疫反应，使肝癌周围组织中 CD4（+）和 CD8（+）T 淋巴细胞大量浸润，从而抑制肝癌细胞增殖。 基于目前国内外的研究现状，TK 基因引物是4根据分子克隆实验指南引

12、物设计的原则 ，利用 GenBank 发表的 DNA 序列上下游分别截选一段核苷酸序列所成，并在上、下游引物中加入目的片段和载体中没有的特异的酶切位点 Not、Xhol，利用酶切鉴定。 进行 DNA 重组重要的是解决目的基因的获得和如何将目的片段进行适当连接两个关键问题。采用 PCR 方法从含有目的基因的人类单纯疱疹病毒基因组中扩增出目的基因片段，然后通过琼脂糖凝胶电泳分离 DNA 片段，回收需要的目的基因片段，通过载体特有的 T 末端和 PCR 扩增目的片段两端形成的 ployA 尾巴，用 DNA 连接酶进行连接，得到了克隆质粒。 【参考文献】 1 Moolten FL. Tumor che

13、mosensitivity conferred by inserted herpes thymidine kinase genes：paradigm for a prospective cancer control strategyJ Cancer Res, 1986，46（10）：5276-5281. 2 Sung MW, Yeh HC, Thung SN, et al. Intratumoral adenovirus-mediated suicide gene transfer for hepatic metastases from colorectal adencarcinoma:res

14、ults of a phase I clinical trialJ. Mol Ther, 2001,4(3): 182-191. 3 Kuriyama S, Masui K, Kikukawa M, et al. Complete cure of established murine hepatocellular carcinoma is achievable by repeated injections of retroviruses carrying the herpes simplex virus thymidine kinase gene J. Gene Therapy, 1999, 6(4): 525-533. 4 萨姆布鲁克J，拉塞尔DW. 分子克隆实验指南M. 第 2版. 北京：科学出版社，2002:679-684.